荧光蛋白文库构建及FRET技术筛选钙调素结合蛋白

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Ca2+是细胞中普遍存在的第二信号分子,它调控许多不同的细胞内进程,包括细胞增殖,发育,迁移,分泌,学习和记忆。钙调素(CaM)是细胞内Ca2+信号的主要受体,在细胞增殖、分化、凋亡、迁移等过程中都起着重要作用。由于CaM 本身并不具有任何酶活性,其发挥生物学效应的关键在于它能够和钙调蛋白效应因子结合,引起这些效应因子生物学活性的改变,进而参与生命活动的调控。   因此,研究钙调蛋白效应因子有助于进一步揭示CaM的生理功能。为了更好地研究CaM在细胞周期调控中的重要作用,就要试图找到CaM在周期细胞中的下游效应因子。为此我们设计了一种新型大规模筛选CaM 结合蛋白的实验。   我们通过Cre-loxP位点特异性重组技术构建了一个带有CFP 荧光蛋白标记的文库,与YFP-CaM 共同转染细胞,进行荧光能量共振转移(FRET)检测。如果发生荧光能量共振转移并且计算结果在可信范围内,则认为与CaM 发生相互作用。利用膜片钳微电极玻璃毛细管吸取发生FRET的单个细胞,进行单细胞PCR。   测序扩增出的片段,通过与已知蛋白序列数据库进行比对,得出与CaM 相互作用的蛋白。通过这种手段我们可以筛选出未知的与CaM 相互作用的蛋白,从而为进一步研究CaM 蛋白在生理环境下的作用提供条件。甚至,我们可以利用这个方法筛选任意两种相互作用的蛋白,从而丰富了大规模筛选的方法。目前我们已经通过这种方法成功的筛选到了一些与CaM 相结合的蛋白。从而成功确立这一新的大规模筛选CaM 结合蛋白的方法。
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