研究背景急性呼吸道感染(Acute respiratory tract infections，ARTIs)是世界范围内人群健康的主要问题，是导致5岁以下儿童死亡的第二大原因。引起呼吸道感染的主要病原体主要包括病毒、细菌、支原体、衣原体等，而病毒感染是导致呼吸道感染的非常重要的一种病因。据统计，大约90%的病例为呼吸道病毒所致。建立起快速、准确的鉴别诊断技术，可对呼吸道病毒的疫情进行实时监测，在流行早期及时调整和完善相应的防治措施，防止疾病的进一步蔓延，为防控措施的效果评价提供科学依据；可在发病初期快速进行临床病因学确诊与治疗处理，降低病人并发症发生率及死亡率，减轻国家及个人的疾病负担与经济负担，具有重要的社会意义；能够用于疾病预防控制系统、出入境检验检疫系统和临床医学检验系统，具有重要的实用价值和现实推广意义。呼吸道病毒鉴别诊断技术主要可以分为传统方法以及分子生物学方法这两大类。而传统的实验室检测方法存在较多的缺陷及不足，无法满足对呼吸道病毒进行快速准确鉴别的要求。随着分子生物学的快速发展，越来越多的新型检测手段被用于呼吸道病毒的鉴别领域之中，近年来，实时荧光定量PCR技术及实时荧光定量RT-PCR技术由于具有灵敏度高，特异性强，能实现多重反应，具有自动化程度高、无污染性、实时性和准确性的优势，在分子诊断领域发展最快，应用最成熟也最常被采用。呼吸道病毒种类繁多，其中既有DNA病毒，又有RNA病毒，为了同时检测两种类型的病毒，可采用实时荧光定量RT-PCR方法。多重实时荧光定量RT-PCR技术是在实时荧光定量RT-PCR技术上发展起来的一种技术，通过选定多重荧光通道，通过在1个反应体系之中加入多对引物与多条探针（分别标记不同的荧光基团），可实现对多种核酸模板的检测，即可进行多种呼吸道病毒的分子鉴别诊断。目前，由于荧光RT-PCR仪检测通道的限制，多色荧光体系检测最多只能实现4个或5个目标序列的同时检测，除了依靠科技进步不断增加检测通道数量，想要提高检测核酸样本数量必须另辟蹊径。在这个基础上，多色组合探针编码（Multicolor Recombination Probe Coding, MCPC）技术被提出。同时，同源加尾（Homo-Tag Assisted Non-Dimer, HAND）系统通过在上游引物和下游引物的5’端分别加上相同的标签，可以大大减少引物二聚体的形成，降低引物二聚体对荧光RT-PCR反应的干扰。国内外的实验研究表明，利用目前应用广泛的多通道实时荧光定量RT-PCR仪，同时检测3种荧光因素完全可行。通过采用MCPC技术和HAND系统，可在目前所广泛使用的多通道实时荧光定量RT-PCR仪上实现同时检测7种核酸模板的分子诊断，可以突破实时荧光定量RT-PCR仪自身荧光信号检测通道的限制，减少引物二聚体的形成，降低引物二聚体对荧光RT-PCR反应的干扰。本研究基于多重实时荧光定量RT-PCR技术、MCPC技术及HAND系统，以期能够建立人腺病毒（human adenovirus, HADV）、人博卡病毒(human bocavirus,HBoV)、人偏肺病毒（human metapneumovirus, HMPV）、人呼吸道合胞病毒（human respiratory syncytial virus, HRSV）等四种呼吸道病毒的实时荧光定量RT-PCR体系，建立这4种呼吸道病毒的鉴别诊断体系标准，也为所有呼吸道病毒的快速、准确的多重鉴别诊断技术提供一种可能的方法。研究方法1、特异性结合引物、加尾引物与探针设计与合成：从Genebank分别下载若干条HADV、HBoV、HMPV、HRSV的基因序列，选择高保守区域进行特异性结合引物和TaqMan探针的设计。在特异性结合引物序列的基础上，在5’端添加一段通用引物序列，得到加尾引物。合成特异性结合引物、加尾引物与探针。2、目的序列阳性克隆菌和体外RNA转录：分别选出4种呼吸道病毒的两引物目标位点之间的基因片段，将其作为研究中的目的序列。委托大连宝生物公司制造阳性克隆菌。摇菌，离心，弃上清，提取质粒DNA，委托大连宝生物公司体外转录RNA。3、临床样本核酸模板的制备：以HADV、HBoV、HMPV、HRSV四种呼吸道病毒，以及引起相似临床症状的其他类型呼吸道病毒的咽拭子临床样本提取核酸作为模板，使用Roche公司的High Pure Viral Nucleic Acid Kit试剂盒提取病毒核酸模板。4、单重实时荧光定量RT-PCR体系的建立：确定初步的反应体系和反应条件，完成单重荧光RT-PCR实验；通过设置温度梯度，确定反应的退火延伸温度；使用106-101copies/μl各个稀释度的体外转录RNA探索单重荧光RT-PCR体系的灵敏度；绘制反应体系的标准曲线，计算单重荧光RT-PCR反应的扩增效率；每孔设置3个平行样，计算CT值均数及标准差，得到3个CT值的变异系数，检验反应体系的重复性；以临床样本提取核酸作为模板，检验反应体系的特异性。5、多重实时荧光定量RT-PCR体系的建立：确定反应体系和反应条件，完成多重荧光RT-PCR实验；使用106-101copies/μl各个稀释度的体外转录RNA探索多重荧光RT-PCR体系的灵敏度；绘制反应体系标准曲线，计算多重荧光RT-PCR反应的扩增效率；每孔设置3个平行样，计算CT值均数及标准差，得到3个CT值的变异系数，检验反应体系的重复性；以临床样本提取核酸作为模板，检验反应体系的特异性。6、 HAND多重实时荧光定量RT-PCR体系的建立：探索加尾引物的浓度，在此实验结果基础上，完成探针的浓度探索实验；使用106-101copies/μl各个稀释度的体外转录RNA探索HAND多重荧光RT-PCR体系的灵敏度；绘制反应体系的标准曲线，计算HAND多重荧光RT-PCR反应的扩增效率；每孔设置3个平行样，计算CT值均数及标准差，得到3个CT值的变异系数，检验反应体系的重复性；以临床样本提取核酸作为模板，检验反应体系的特异性。研究结果1、单重荧光RT-PCR体系的建立与检验：HADV、HBoV、HMPV、HRSV这4种呼吸道病毒的单重荧光RT-PCR体系均成功建立，而反应退火延伸温度在达到60℃时仍然能够准确检出体外转录RNA，所建立的单重荧光RT-PCR反应体系对4种病毒的检出灵敏度均达到10copies/μl，标准曲线的决定系数分别为：HADV的R2=0.9998, HBoV的R2=0.9981, HMPV的R2=0.9981,HRSV的R2=0.9947和0.9965，扩增效率分别为：HADV105.08%，HBoV107.81%，HMPV102.08%，HRSV FAM荧光106.38%及CY5荧光107.95%，单重荧光RT-PCR反应体系检测体外转录RNA的各个拷贝数浓度的变异系数均较低，对临床样本检验的特异性为100%。2、多重荧光RT-PCR体系的建立与检验：HADV、HBoV、HMPV、HRSV这4种呼吸道病毒的多重荧光RT-PCR体系成功建立，所建立的多重荧光RT-PCR反应体系对4种病毒的检出灵敏度均达到10copies/μl，标准曲线的决定系数分别为：HADV的R2=0.9985, HBoV的R2=0.9998, HMPV的R2=0.9965,HRSV的R2=0.9966和0.9954，扩增效率分别为：HADV103.63%，HBoV102.65%，HMPV100.37%，HRSV FAM荧光105.54%及CY5荧光104.07%，多重荧光RT-PCR反应体系检测体外转录RNA的各个拷贝数浓度的变异系数均较低，对临床样本检验的特异性为100%。3、 HAND多重荧光RT-PCR体系的建立与检验：HADV、HBoV、HMPV、HRSV这4种呼吸道病毒的最适上下游加尾引物的加入量分别为：HADV上下游加尾引物0.15μl，HBoV上下游加尾引物0.10μl，HMPV上下游加尾引物0.10μl，HRSV上下游加尾引物0.10μl。4种呼吸道病毒的最适探针的加入量分别为：HADV探针0.30μl，HBoV探针0.25μl，HMPV探针0.30μl，HRSV的两条探针各0.15μl共0.30μl。所建立的HAND多重荧光RT-PCR反应体系对4种病毒的检出灵敏度均达到102copies/μl，标准曲线的决定系数分别为：HADV的R2=0.9977, HBoV的R2=0.9969, HMPV的R2=0.9985,HRSV的R2=0.9969和0.9979，扩增效率分别为：HADV99.58%，HBoV96.45%，HMPV98.64%，HRSV FAM荧光93.32%及CY5荧光94.62%，HAND多重荧光RT-PCR反应体系检测体外转录RNA的106-102copies/μl各个拷贝数浓度的变异系数均较低，对临床样本检验的特异性为100%。研究结论1、成功建立了HADV、HBoV、HMPV、HRSV这4种呼吸道病毒的单重实时荧光定量RT-PCR体系，经过检验，体系的灵敏度均达到10copies/μl，扩增效率高，重复性及特异性好。2、成功建立了HADV、HBoV、HMPV、HRSV这4种呼吸道病毒的多重实时荧光定量RT-PCR体系，经过检验，体系的灵敏度均达到10copies/μl，扩增效率高，重复性及特异性好。3、成功建立了HADV、HBoV、HMPV、HRSV这4种呼吸道病毒的HAND多重实时荧光定量RT-PCR体系，体系的灵敏度均达到102copies/μl，整体降低了1个数量级，但仍具有较高的灵敏度。体系的扩增效率高，重复性及特异性好。后续研究需对反应体系进行进一步的优化，希望能够提高反应的灵敏度与扩增效率。4、本实验所建立的多重实时荧光定量RT-PCR体系，可快速、准确地检测人腺病毒、人博卡病毒、人偏肺病毒、人呼吸道合胞病毒等四种呼吸道病毒，从模板的制备到结果的获得仅需要2个小时，有望为所有呼吸道病毒的快速、准确的多重鉴别诊断提供一种可能的方法。