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缢蛏(Sinonovacula constricta),又名蛏子,是我国重要的海水养殖贝类。肾上腺素能受体(adrenergic receptor)是一种G蛋白偶联受体(G-protein coupled receptors),与生物体的生长、内分泌和代谢等生理活动有着密切的联系。本研究通过缢蛏转录组筛选出两个肾上腺素能受体,通过RACE技术获得了两个基因的cDNA全长序列,分析了两个肾上腺素能受体基因的序列特征和时空表达模式,鉴定两个肾上腺素能受体的类型;进一步分析了肾上腺素能受体在缢蛏水管损伤修复和幼虫发育过程中的作用。1.本研究获得的两个缢蛏肾上腺素能受体的片段序列来自于缢蛏(S.constricta)转录组文库。通过PCR和RACE技术获得肾上腺素能受体的cDNA全长序列,分别命名为ScADRA2和ScADRB2。ScADRA2基因cDNA全长2606bp,包括826bp的5’端非编码区,433bp的3’的非编码区,以及1347bp的开放阅读框,编码448个氨基酸;ScADRB2长度为1497 bp,包括148bp的5’UTR,191 bp的3’UTR,以及1158 bp的开放阅读框,编码385个氨基酸。基因序列特征分析显示两个基因都属于G蛋白偶联受体,均具有7个跨膜区,在第3个跨膜区和第4个跨膜区之间都有着DR的保守序列。Blast比对结果显示ScADRA2与α2肾上腺素能受体相似度最高,而ScADRB2与β2肾上腺素能受体相似度最高。2.选取α2受体激动剂可乐定clonidine,β受体激动剂异丙肾上腺素isoprenaline,α2受体抑制剂育亨宾yohimbine,β受体抑制剂普萘洛尔propranolol以及无菌海水作为对照组进行注射,浓度为10μmol/l。注射两小时后取样,检测缢蛏斧足中的cAMP含量,并通过荧光定量PCR分析ScADRA2在clonidine和yohimbine诱导下的表达量变化,以及ScADRB2在isoprenaline和propranolol诱导下的表达量变化。结果显示,注射isoprenaline后cAMP含量显著上升,注射yohimbine后cAMP含量有所上升,注射clonidine和propranolol后cAMP含量均显著下调。注射clonidine和yohimbine后,ScADRA2基因的表达量显著上调;而isoprenaline和propranolol后,ScADRB2基因的表达量显著上调。因此,ScADRA2属于α2肾上腺素能受体,而ScADRB2属于β2肾上腺素能受体。3.通过实时荧光定量PCR检测ScADRA2和ScADRB2 mRNA在各组织和不同发育时期的表达量。在血淋巴、外套膜、斧足、鳃、肝胰腺、性腺和水管组织的表达量结果显示,ScADRA2基因在各个组织中均有表达,在外套膜、斧足和鳃的表达相对较高,而在血淋巴和性腺中的表达相对较低;ScADRB2基因在外套膜的表达量最高,其次为斧足,在水管和性腺中的表达量较低,而在血淋巴、肝胰腺和鳃中的表达量最低。在受精卵期、卵裂期、担轮幼虫、D形幼虫、壳顶幼虫、匍匐幼虫、单水管期、稚贝期发育阶段的表达量结果显示,随着缢蛏的发育,ScADRA2基因的表达量越来越高,在受精卵时期和卵裂期基本不表达,而在稚贝期表达量达到最高;ScADRB2基因的表达量在壳顶期和单水管期有所下调,其他时期随着个体的发育均上调。4.设计组织损伤实验,损伤缢蛏的进水管,在处理后第8 h、24 h、36 h、48 h、60 h和72 h分别取样。通过荧光定量PCR分析,结果表明,ScADRA2基因实验组和对照组之间的相对表达量,总体呈现“下调-上升-下调”的表达模式,实验组和对照组之间没有显著差异。ScADRB2基因实验组和对照组之间的相对表达量在8h和36h有显著差异,总体呈现“上升-下调-上升-下调”的表达模式。研究结果表明,缢蛏的β2肾上腺素能受体可能参与了损伤修复的过程。5.使用不同浓度α2受体抑制剂yohimbine和β2受体抑制剂propranolol的海水溶液来分别浸泡担轮幼虫、D形幼虫和匍匐幼虫时期的缢蛏幼虫,以海水为对照组,观察浸泡后的存活率和变态率,并通过荧光定量PCR检测D型幼虫浸泡后的ScADRA2和ScADRB2基因的表达量变化。结果表明,在yohimbine处理下,担轮幼虫经过20h后存活率和变态率没有明显的变化,D型幼虫经过1d后存活率和变态率明显下降,匍匐幼虫经过抑制剂处理5d后存活率变化不大;在propranolol处理下,担轮幼虫的存活率和变态率变化不大,而D型幼虫和匍匐幼虫的存活率和变态率明显下降,在最高浓度的propranolol下,超过95%的D型幼虫和匍匐幼虫死亡。随着两种抑制剂浓度的升高,变态率和存活率有呈现降低的趋势。荧光定量结果表明,两种抑制剂处理D型幼虫1d后,肾上腺素能受体的表达量上调且抑制剂的浓度越高,肾上腺素能受体的表达量也越高。研究表明,抑制剂yohimbine和propranolol能抑制缢蛏幼虫的变态发育,α2和β2肾上腺素能受体可能参与了缢蛏幼虫的变态发育。