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研究背景随着世界老龄化的不断加剧,衰老及相关退行性相关的疾病受到越来越多研究者的重视。神经系统退行性疾病在衰老疾病中占重要分支,如帕金森氏病,阿尔茨海默病(Alzheimer’s Disease,AD)等。AD是一种以认知功能障碍、人格改变为主要临床症状的慢性进展性中枢神经系统退行性疾病,是痴呆的最常见原因。AD发病机制尚不明确,且无特效药。为了更好的防治衰老疾病、提高老年人生活质量、减轻社会负担,探讨退行性病变的病理机制、研发有效延缓退行进程的药物有重要意义。淀粉样蛋白级联反应是AD治病机制中的重要假说。不可溶的β淀粉样蛋白(β-amyloid peptide,Aβ)聚集而成的原纤维具有神经毒性,也是老年斑的组成成分。Aβ聚合会引发氧化应激反应,线粒体功能受损,使ROS增多。而氧化应激又会进一步促进Aβ聚集及微管相关蛋白tau的磷酸化,加重AD大脑中的氧化还原反应的失衡。氧化应激是将多种不同的致病机制联络在一起的共同关键点,因此寻找合适的抗氧化剂和多靶点的治疗方法,进行适当的临床干预,是防治AD的有效手段。Nrf2/HO-1在机体内源性抗氧化系统中有至关重要的地位,是最重要的抗氧化通路。Nrf2作为转录因子能启动机体的抗氧化通路。在受到氧化刺激时,Nrf2由胞质转位进入胞核,启动抗氧化酶相关基因的表达,通过调控下游氧化还原基因网,来维持细胞内氧化还原状态的平衡。HO-1是Nrf2下游的抗氧化酶之一,通过对线粒体功能的恢复起到保护神经元的作用。Nrf2/HO-1是机体维持氧化平衡的保护系统。近来发现,柿叶具有抗氧化,降血脂,降血糖,抗菌,止血等药效。临床病例分析报道,柿叶提取物在改善后循环缺血的疗效上优于银杏叶提取物。由柿叶提取物制成的脑心清片,可清除氧自由基,防止神经元兴奋性毒性作用,从而保护脑血管意外引起的脑损伤。在临床治疗中柿叶提取物已被广泛应用,尤其在脑血管病的相关领域中崭露头角。我们前期研究结果发现,柿叶提取物(Persimmon leaf extract,PLE)可以改善D-半乳糖致衰老小鼠的学习与记忆能力,提高抗氧化酶SOD,GSH-Px活性,那么在神经细胞中尤其是AD细胞模型中,是否也有相同的作用?是否可以通过减少Aβ的聚集、减轻ROS的活性,调节Nrf2/HO-1的表达来发挥神经保护作用?基于以上背景,本研究主要探讨柿叶提取物对AD细胞模型的是否有抗氧化作用,以及Nrf2和HO-1是否参与到抗氧化的调节中,为AD的药物研发提供依据。目的:采用携带瑞典突变APP基因的HEK293细胞(20E2)作为AD细胞模型,通过检测细胞上清Aβ1-42的水平,细胞内ROS的荧光强度,线粒体膜电位的变化等相关指标,探讨PLE对细胞抗氧化应激的作用,并从核Nrf2/HO-1信号通路研究其作用机制。方法:1.Western Blotting检测SH-SY5Y和20E2细胞中APP蛋白表达水平;ELISA检测两组细胞上清Aβ1-40,以确定该病理模型是否建立成功。2.CCK-8检测不同浓度的PLE对两组细胞活性的影响,选定干预最佳浓度。3.设分组:SH-SY5Y为空白对照组(NC组)20E2为模型组(20E2组),用柿叶提取物干预为加药组(20E2+PLE组)。4.DCFH-DA探针检测各组细胞内ROS的变化。5.JC-1检测线粒体膜电位的变化。6.ELISA检测各组细胞上清Aβ1-42的量。7.Western Blotting分析胞核Nrf2、胞浆Nrf2和全细胞HO-1蛋白的表达差异。结果:1.检测两种细胞中的APP、Aβ1-42蛋白表达:与SH-SY5Y细胞相比,20E2细胞APP表达量明显增加(P<0.01),Aβ1-40的量明显增加(P<0.01)。2.CCK-8检测不同浓度的PLE对两组细胞活性的影响:结果显示PLE在1.5-6μg/mL可增加SH-5Y5Y细胞活性(*P<0.05);PLE在3-6μ g/mL可增加20E2细胞活性(#P<0.05),超过6 μ g/mL后也有抑制细胞活性的趋势。3.DCFH-DA荧光探针检测各组细胞ROS的表达:与NC组相比,20E2组细胞内ROS荧光信号明显增强(P<0.05);PLE干预后,20E2+PLE组ROS荧光信号减弱(P<0.05)。4.JC-1检测线粒体膜电位结果:较NC组细胞,20E2组细胞,红色荧光较弱(P<0.05),绿色荧光较强(P<0.05),线粒体膜电位降低;用PLE干预后,20E2+PLE组细胞内的红色荧光强度增强(P<0.05),绿色荧光较弱(P<0.05),线粒体膜电位有上升。5.ELISA检测细胞外Aβ1-42浓度结果:与NC组细胞相比,20E2组细胞外Aβ1-42明显增多(P<0.05);PLE干预后,20E2+PLE组细胞外Aβ1-42明显减少(P<0.05)。6.分析胞核Nrf2、胞浆Nrf2和全细胞蛋白HO-1的表达差异:相比于NC组,20E2细胞中Nrf2蛋白和HO-1蛋白表达增多(P<0.05);相比于模型组,加药组中胞核Nrf2表达增加,胞浆Nrf2表达减少,全细胞蛋白HO-1 增多(P<0.05)结论PLE能明显降低细胞外Aβ的浓度,减少ROS的产生,恢复线粒体膜电位水平。可能是通过激活了 Nrf2/HO-1信号途径,促进Nrf2合成和核转位,从而促进下游抗氧化蛋白HO-1的表达来减弱氧化应激的损伤。因此,PLE能降低AD细胞模型的氧化应激的水平,对AD具有一定的治疗保护作用。