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为了筛选适合冷冻保存小鼠成熟卵母细胞的冷冻保护剂,并且初步探明小鼠成熟卵母细胞在冷冻过程中的损伤机制,本研究采集ICR雌性性成熟小鼠的成熟卵母细胞,采取细管法使用不同的冷冻保护剂(EFS40,VS1,A10-10)冷冻保存小鼠成熟卵母细胞,解冻后通过体外受精,体外培养及免疫荧光染色,检测冷冻-解冻后的小鼠成熟卵母细胞的受精与发育能力及活性与细胞骨架的变化。此外,为了探明适合小鼠不同时期胚胎的冷冻保护剂,本研究使用不同的冷冻保护剂(EFS40,EFS20-40,DAP213,GP25)采取细管法冷冻保存处于不同时期的小鼠早期胚胎(2细胞,4-8细胞及桑椹胚),解冻后将胚胎进行体外培养,观察其发育至扩张囊胚的能力。
研究结果与结论如下:
1.采用EFS、VSI及A10-10冷冻保存的小鼠成熟卵母细胞解冻后进行体外受精及体外培养,其结果,当用A10-10作为冷冻保护剂玻璃化冷冻小鼠成熟卵母细胞时,其回收后的形态正常率(68.0％)显著高于EFS和VS1(分别为16.7％和12.5％)(P＜0.01),而且受精率(11.8％)也显著高于EFS和VS1(分别为0％和0％)(P＜0.01)。表明,A10-10适用于冷冻保存小鼠成熟卵母细胞;
2.将冷冻保存的小鼠成熟卵母细胞解冻,将其切割透明带后进行体外受精,发现切割的卵母细胞受精率(54.8％)显著高于未切割的卵母细胞受精卵(11.8％)。表明玻璃化冷冻-解冻过程可能改变透明带的结构,阻碍精子入卵而小鼠成熟卵母细胞体外受精率降低;如果在透明带上人为制作切口,则可促进精子入卵,以提高冷冻保存的小鼠成熟卵母细胞的体外受精率;
3.采用免疫荧光染色检测小鼠成熟卵母细胞在冷冻前后的活性及细胞骨架的结果显示,不仅冷冻解冻过程对卵母细胞形态结构产生损伤作用,而且,高渗的冷冻保护剂处理同样改变卵母细胞的活性和细胞骨架;
4.使用不同的冷冻保护剂(EFS40,EFS20-40,DAP213,GP25)采取细管法冷冻保存处于不同时期的小鼠早期胚胎(2细胞,4-8细胞及桑椹胚),解冻后将胚胎进行体外培养的结果显示,EFS20-40、EFS40、DAP213和GP25四种冷动保护剂中,与含有EG的EFS20-40和EFS40相比,含有GL和DMSO成分的GP253和DAP21对胚胎更具毒性;
5.EFS20-40法适合用于小鼠的2细胞期和桑椹胚的冷冻保存,而EFS40法适合用于4-8细胞期胚胎的冷冻。