白细胞介素-12 (Interleukin-12, IL-12)是免疫网络中占有十分重要地位的核心细胞因子,是连接先天固有免疫与后天获得性免疫的桥梁,免疫调节作用和生物学效应包括:1) IL-12调节Th1/Th2应答,使其向Th1倾斜,诱导Th1细胞发育和增殖,增强T细胞的杀伤功能;2)活化NK细胞产生细胞毒作用,增强NK/LAK细胞溶解活性,促进NK细胞的增殖。3) IL-12诱生T细胞、NK细胞产生IFN-γ。重组人白细胞介素-12 (Recombinant Human Interleukin-12,rhIL-12)是新型生物药物,是利用基因工程技术将人IL-12质粒转染致CHO细胞,通过细胞培养和蛋白质纯化,最终获得产品。rhIL-12作为功能强大的细胞因子,除了其自身可直接治疗疾病,其作为免疫佐剂与特异性抗原蛋白联合使用也具有广泛的应用前景。国外的临床试验研究表明,rhIL-12在临床上用作免疫佐剂,已显示了初步的效果,具有广泛的应用前景。本研究的内容主要是,以rhIL-12为佐剂与重组表面抗原(rHBsAg)疫苗联合组成治疗性乙型肝炎疫苗,评价rHBsAg联合rhIL-12治疗慢性乙型肝炎(Chronic Hepatitis B, CHB )的临床前安全性和有效性。1临床前安全性评价1.1rhIL--12与rHBsAg疫苗联合应用单次给予小鼠的毒性试验试验分为rhIL-12单用(静脉注射)组、rhIL-12单用(皮下注射)组、以及rhIL-12 (皮下注射)与重组乙型肝炎疫苗(肌肉注射)联合应用组,rhIL-12的给药剂量为4000 μg/kg,疫苗的给药剂量为600 μg/kg,另设生理盐水对照组(静脉注射),给药后连续观察14天。结果表明,试验期间雌性动物食量未见明显异常,药后1-3和4-7天雄性动物各给药组食量与同期同性别对照组比较略有减少,药后8-14天,rhIL-12单用静脉注射组和rhIL-12与乙肝疫苗联合应用组雄性动物食量开始恢复,而rhIL-12单用皮下注射组雄性动物食量仍较少,未见恢复;雌性动物各给药组体重在药后3天、7天和14天与同期同性别对照组比较,未见统计学差异,药后7天和14天,雄性动物各给药组体重增长略见减缓,其中药后14天IL-12单用静脉注射组雄性动物体重与同期同性别对照组比较有统计学差异(P<0.05);试验期间没有动物死亡;观察期结束后对动物实施安乐死并解剖,肉眼观察各动物主要脏器未见异常。因此在本试验条件下,rhIL-12单次皮下注射和静脉注射给予小鼠的最大耐受量(MTD) ≥4000 μg/kg,rhIL-12 (皮下注射4000 μg/kg)与重组乙型肝炎疫苗(肌肉注射600μg/kg)联合单次给药后也未见毒性反应。1.2 rhIL-12单次给予食蟹猴的毒性试验rhIL-12单次皮下注射给予食蟹猴,给药剂量为112.5和253.2μg/kg,每个剂量给予1只动物。给药后进行临床观察、体重、体温、心电图、血液学、血液生化、尿常规等指标检查。观察14天后,将动物安乐死,进行了大体解剖观察和部分组织器官的病理学检查。结果表明,给药剂量为112.5μg/kg的动物临床观察未见异常表现。该动物的体重给药后略有下降。Hb、RBC、HCT、WBC和PLT在给药后呈下降趋势,药后14天基本恢复。ALT于药后14天明显升高,达到229U/L; AST于药后7天明显升高,药后14天略有降低,但仍然较高。TBIL在给药后升高,TG药后7天有一过性升高,药后14天恢复。药后7天该动物尿中UBG出现升高。病理检查发现部分组织脏器淋巴细胞增生或浸润。其他指标包括体温、食量、心电图和凝血功能指标均未见与给药相关的明显异常改变。253.2μg/kg剂量组的动物临床观察未出现异常表现。该动物的体重给药后略有下降。Hb、RBC、HCT、WBC和PLT在给药后呈下降趋势,药后14天基本恢复。ALT和AST于药后1天即明显升高,药后7天最高,分别为485U/L和511U/L,药后14天略有恢复;APTT药后7天延长,ALP药后7天升高,药后14天均略有恢复;CK于药后1天和3天明显升高,药后7天和14天逐渐恢复。TBIL在给药后升高,TG药后7天有一过性升高,药后14天恢复。病理检查发现了可能与免疫调节相关的病理改变,主要表现为淋巴细胞的增生或组织浸润。其他指标包括体温、食量和心电图指标均未见与给药相关的明显异常改变。本试验条件下,112.5 μg/kg和253.2μg/kg两个剂量单次给药,对动物骨髓造血系统、肝脏、心脏和免疫系统造成了不同程度的影响。重组人白细胞介素12 (rhIL-12)单次皮下注射给予食蟹猴的最大耐受剂量为253.2μg/kg。1.3 rhIL-12给予豚鼠的全身主动过敏反应试验试验共设4组,分别为阴性对照组(PBS缓冲液)、阳性对照组(人血白蛋白)、供试品低剂量组(2μg/kg)和高剂量组(20μg/kg),每组6只豚鼠。致敏采用皮下注射,隔日1次共3次,末次致敏后14天静脉注射两倍致敏剂量进行激发。阴性对照组和阳性对照组给药方法、时间与供试品组相同。结果表明,阴性对照组豚鼠过敏反应为阴性;阳性对照组豚鼠过敏反应为阳性至极强阳性,其中有1只动物激发给药后死亡;供试品低剂量组有1只动物激发给药后8分钟出现排尿反应,考虑为应激反应所致,供试品组其余动物在激发后均未见过敏反应症状。结果表明,在本试验条件下,rhIL-12给予豚鼠的全身主动过敏反应为阴性。1.4 rhIL-12与rHBsAg疫苗反复给予食蟹猴13周的毒性试验为评价rhIL-12以及与重组乙型肝炎疫苗联合应用反复给药的安全性,本试验选用食蟹猴42只,雌雄各半,随机分为7组,分别为阴性对照组、单用疫苗组、单用rhIL-12低、中、高剂量组和疫苗与低、高剂量rhIL-12联用组。rhIL-12给药剂量分别为0.5、5、40μg/kg,每周给药3次,共给药40次,疫苗的给药剂量为每只动物90μg,每4周给药一次,共给药4次。给药结束对每组4/6的动物实施安乐死,剩余动物进行4周的恢复期观察。试验期间对动物进行一般临床观察,监测了动物体重、体温、摄食量、心电图、血液学、血生化、尿常规等指标和血清抗体产生情况,并进行了眼科检查;对所有动物均进行了系统尸检和主要组织器官的组织病理学检查。单用rhIL-12 40μg/kg组:有2只动物出现腹泻,2只动物出现面部及下颌区肿胀。给药期间该组6只动物均出现了腹股沟淋巴结肿大,有1只动物出现了注射局部红斑。血液学指标出现了 Lymph和EOS的降低,Neut、BASO和LUC的升高,RBC、HGB、HCT、MCV —过性降低,RetL比例先增加后降低。生化指标出现一过性血清CHO、Alb、A/G、Ca、Na+、C1-及P浓度降低,CK、AST和TG升高。CD3、CD8细胞比例增加,CD4细胞比例下降。给药7次后,所有动物均产生了抗IL-12的中和性抗体。疫苗与rhIL-12 40μg/kg联用组:有5只动物出现腹泻,其中1只动物临床症状较重,出现了明显消瘦、精神状态差和全身多处溃疡等症状。给药期间该组6只动物均出现了腹股沟淋巴结肿大,有2只动物皮下注射部位出现红斑。血液学、生化及免疫学指标的变化与单用rhIL-12 40μg/kg组基本一致。rhIL-12给药7次,疫苗给予1次后,所有动物均产生了抗IL-12的中和性抗体和乙肝抗体。单用rhIL-12 5μg/kg组:有3只动物出现腹泻,1只动物出现眼睑和面部肿胀,2只动物出现尾中部溃疡,给药期间有4只动物出现了腹股沟淋巴结肿大,1只动物出现注射局部红斑。血液学指标出现Lymph降低,BASO及LUC增高,RBC、HGB、HCT、MCV—过性降低,给药后期Ret降低。生化指标出现一过性血清 CHO、Alb、A/G、Ca、Na+、Cl-和 P 浓度降低,CK、AST、TG 和 BUN升高。CD3、CD8细胞比例增加,CD4细胞比例下降。给药7次后,所有动物均产生了抗IL-12的中和性抗体。单用rhIL-12 0.5μg/kg组:给药期间该组6只动物均出现了腹股沟淋巴结肿大,1只动物出现注射局部硬结。血液学指标出现了 Lymph、EOS、HCT、MCV的降低,Neut、BASO和LUC增高,恢复较快。生化指标出现血清CHO降低,AST和ALT —过性升高。给药7次后,所有动物均产生了抗IL-12的中和性抗体。疫苗与rhIL12 0.5μg/kg联用组:有1只动物出现腹泻,给药期间该组6只动物均出现了腹股沟淋巴结肿大。血液学和生化指标的变化与单用rhIL-120.5μg/kg组基本一致。rhIL-12给药7次,疫苗给予1次后,所有动物均产生了抗IL-12的中和性抗体和乙肝抗体。单用疫苗组:给药期间有1只动物出现腹股沟淋巴结肿大。疫苗给予1次后,所有动物均产生了乙肝抗体。病理组织学检查未见各给药组与给药相关的大体及镜下观察异常病理改变。皮下连续注射rhIL-12可引起注射局部刺激反应,停药4周后注射局部反应明显消退。毒代动力学结果显示,首次给药后,rhIL-12的0.5、5及40μg/kg给药组的AUC(0-∞)分别为 0.039±0.005、0.543±0.056 和6.029±0.715μg·h/mL; Cmax分别为1.55±0.17,23.34±9.95 和 155.79±4.04μg·h/mL; T1/2 分别为 12.82±2.88,19.01±5.66和27.11±6.96 h;疫苗与0.5及40μg/kg rhIL-12联用组的AUC(0-∞)分别为0.036±0.009 和 7.314±1.155 μg·h/mL; Cmax 分别为 1.29±0.30 和 186.20±26.21μg.h/mL; T1/2分别为16.05±4.76和21.24±2.03h。第10及第39次药后,由于大部分动物的药物浓度低于检测限,毒代动力学参数未计算。综上所述,rhIL-12皮下注射给予食蟹猴,给药剂量为0.5、5、40μg/kg,每周给药3次,共给药40次,同时设重组乙型肝炎疫苗与低剂量和高剂量rhIL-12联用组,疫苗的给药剂量为每只动物90μg,每4周给药一次,共给药4次。rhIL-12给药导致动物出现腹泻、面部及眼睑部肿胀、腹股沟淋巴结肿大、溃疡、及注射局部红斑和硬结等临床症状,并出现贫血和白细胞分类异常,生化指标出现肝脏转氨酶和肌酸激酶升高、低蛋白血症及血清总胆固醇、Ca、Na+、Cl-及P浓度降低。免疫学指标出现外周血总T淋巴细胞比例增加,CD4细胞百分率下降、CD8细胞百分率增加。因此,在本试验条件下,rhIL-12皮下注射给予食蟹猴,毒性靶器官和组织为血液系统、肝脏、心脏、肾脏和淋巴结等免疫调节系统。0.5μg/kg为基本安全剂量。单用疫苗组未见明显异常反应,疫苗联用组与相应的rhIL-12单用组,反应基本一致,临床症状及检测指标未见明显差别。rhIL-12首次给药,疫苗联用组与相应的rhIL-12单用组在食蟹猴体内的动力学参数无差别。因此,在本试验条件下,疫苗与rhIL-12联用未明显增加rhIL-12的毒性。rhIL-12首次给药后的药物浓度呈现剂量依赖性,药物达峰浓度与给药剂量成正比;系统暴露量(AUC)与剂量呈现线性关系。rhIL-12反复给予食蟹猴,动物体内产生抗rhIL-12抗体,抗体具有中和rhIL-12活性的作用。连续给药10次及以上时,血清中的rhIL-12浓度显著降低,大部分动物无法检测到。rhIL-12反复皮下注射给予药食蟹猴,对注射局部有明显刺激性损伤,停药4周后可基本恢复。2临床前有效性评价2.1体外药效学研究取CHB患者外周静脉血5ml,分离PBMCs,加刺激物:RPMI-1640基础培养液空白对照、rHBsAg0.5μg/ml、rhIL-12 (0.01 ng/ml、0.1 ng/ml和 1 ng/ml)和rHBsAg0.5μg/ml+rhIL-12 (0.01ng/ml、0.1ng/ml和1ng/ml),置37℃、5%CO2培养箱孵育72h后,在无菌条件下收集无细胞上清液,ELISA方法测定IFN-γ含量。结果表明,0.5μg/mlrHBsAg单独对CHB患者PBMCs刺激72h后诱生的IFN-y含量(11.65±9.74)很低,与对照组相比差异无统计学意义;rhIL-12 0.01、0.1、1 ng/ml单独对CHB患者PBMCs刺激72h后诱生的IFN-y含量分别为:214.17±82.07、452.68±145.13和870.78±373.05,与对照组相比有统计学意义上的显著性差异(P<0.01); rhIL-12 0.01、0.1、1ng/ml联合rHBsAg对CHB患者PBMCs刺激72h后诱生的IFN-γ含量分别为:424.53±145.21、821.17±283.55和 1561.42±602.77,与对照组相比有统计学意义上的显著性差异(P<0.01); 3个rhIL-12联合rHBsAg组诱生的IFN-γ要高于同剂量的rhIL-12组,且差异有统计学意义(P<0.01); 3个rhIL-12联合rHBsAg组之间诱生IFN-γ比较有统计学意义上的差异(P<0.01),且随着rhIL-12剂量的增加,IFN-γ的量也升高。取CHB患者外周静脉血20ml,分离PBMCs,分别加入RPMI-1640基础培养液、rHBsAg 0.5μg/ml、rhIL-12 lng/ml 和 rHBsAg0.5μg/ml+rhIL-12 lng/ml 培养24h,加抗体标记,流式细胞仪检测细胞内的IFN-γ。结果表明,CHB患者PBMCs用不同刺激物培养24h后细胞内IFN-γ的细胞来源主要有:CD4+ T细胞、CD8+T细胞和NK细胞(CD56+细胞);rHBsAg组对CD4+T细胞、CD8+T细胞和NK细胞诱生的IFN-γ均较低(分别为:0.40±0.15、0.09±0.02和0.16±0.09),与对照组比较均无统计学意义上的差异;rhIL-12组和rhIL-12联合rHBsAg组均能诱导CD4+T细胞、CD8+T细胞和NK产生IFN-γ,与对照组相比各种细胞内的IFN-γ升高,且差异具有统计学意义;rhIL-12联合rHBsAg组在CD4+T细胞、CD8T+T细胞内诱生的IFN-γ量,比rhIL-12组和rHBsAg组均有所升高,且差异具有统计学意义;rhIL-12联合rHBsAg组在NK细胞内诱生的IFN-y量与rhIL-12组相比无统计学意义上的差异。2.2体内药效学研究48只HBV转基因小鼠,随机分为6组,每组8只,分别为:对照组(生理盐水)、rmIL-12 组(0.9μg/只)、rHBsAg 组(6μg/只)、低剂量联合组(rmIL-12 0.lμg/只+rHBsAg μg/只)、中剂量联合组(rmIL-12 0.3μg/只+rHBsAg6μg/只)和高剂量联合组(rmIL-12 0.9μg/只+rHBsAg6μg/只)。rmIL-12为后肢皮下注射给药,每周给药2次;rHBsAg为后肢肌肉注射给药每周1次,12周后改为2周1次,共治疗24周。各组小鼠给药前、rmIL-12第1次给药后24h、rmIL-12第24次给药(12周)后24h和rmIL-12第40次给药(24周)后24h分别自眼球后静脉oaoo a a a a (?).BsAg0.2μg /ml体外刺激脾细胞,置于37℃、5%CO2的培养箱中孵育,分别于培养18h后,检测IFN-γ含量和细胞来源。IFN-γ检测结果表明,各组给药前、各时间点对照组和rHBsAg组小鼠血清均检测不出IFN-γ; rmIL-12组小鼠在第0周、第12周和第24周血清IFN-γ含量分别为:1127.13±235.32、687.55±183.07 和 258.64±56.16pg/ml;低剂量联合组小鼠在第0周、第12周和第24周血清IFN-γ含量分别为:150.57±43.65、96.17±30.21和66.32±25.78pg/ml;中剂量联合组小鼠在第0周、第12周和第24周血清 IFN-γ含量分别为:471.39±120.09、307.01±66.01 和 165.52±43.10pg/ml;高剂量联合组小鼠在第0周、第12周和第24周血清IFN-y含量分别为:1734.25±411.63、898.38±202.62 和 481.92±170.92pg/ml;高剂量联合组小鼠在第0周和第24周血清IFN-γ含量均高于rmIL-12组,且差异均有统计学意义;3个联合组小鼠在第0周、第12周和第24周血清IFN-γ含量差异均具有统计学意义,且随着rmIL-12剂量的增加小鼠血清IFN-γ水平增高;rmIL-12组和各联合组小鼠血清IFN-γ水平在不同时间点的差异具有统计学意义,且随着给药时间的延长小鼠血清IFN-γ水平降低。血清HBV DNA检测结果表明,各组给药前小鼠血清HBV DNA拷贝数为105;给药12周后,rHBsAg组有2只小鼠降为104, rmIL-12组有3只降为104,2只降为103,低剂量联合组有5只降为104,中剂量联合组有3只降为104, 4只降为103, 1只降为102,高剂量联合组有3只降为103, 4只降为102;给药24周后,rHBsAg组有3只小鼠将为104,5只降为103, rmIL-12组有1只降为104, 5只降为103, 1只降为102,低剂量联合组有5只降为104, 3只降为103,中剂量组有3只降为103,5只降为102,高剂量联合组全部小鼠降为102。rHBsAg组和低剂量联合组在给药24周后小鼠血清HBV DNA拷贝数与对照组相比降低,且差异具有统计学意义;rmIL-12组、中剂量联合组和高剂量联合组在给药12周和给药24周后小鼠血清HBVDNA拷贝数与对照组相比降低,且差异具有统计学意义;高剂量联合组在给药12周和给药24周后小鼠血清HBV DNA拷贝数低于同时期的rmIL-12组和rHBsAg组,且差异具有统计学意义;3个联合组在给药12周和给药24周后小鼠血清HBV DNA拷贝数差异有统计学意义,且rmIL-12剂量越高,小鼠血清HBV DNA拷贝数越低。小鼠脾细胞诱生IFN-γ的检测结果表明,低剂量联合组小鼠脾细胞经rHBsAg刺激后诱生的IFN-γ水平与生理盐水对照组相比无统计学意义上的差异;中剂量联合组和高剂联合量组小鼠脾细胞经rHBsAg刺激后诱生的IFN-γ水平高于生理盐水对照组,且差异具有统计学意义;小鼠脾细胞经rHBsAg刺激后诱生的IFN-γ主要来源于CD4+和CD8+ T细胞。2.3作用机制研究取健康人外周静脉血20ml,分离PBMCs,将浓度为2×106/ml的细胞分别加入3种激活物:阴性对照组、阳性对照组(0.2ug/ml Anti-CD3单抗)、和rHBsAg组(0.5μg/ml),孵育72h,加抗体标记,流式细胞仪检测T细胞表明IL-12R的表达量。结果表明,rHBsAg刺激健康人PBMCs后,CD4+CD212+β1细胞百分率(0.50±0.15%)和CD4+CD212+β2细胞百分率(0.59±0.16%)均比生理盐水对照组升高,且差异具有统计学意义,表明rHBsAg上调了 CD4+T细胞表面的IL-12Rβ1 和 IL-12R β2 的表达;CD8+CD212+β1 细胞百分率(2.55±1.10%)和CD8+CD212+β2细胞百分率(1.33±0.51%)均比生理盐水对照组升高,且差异具有统计学意义,表明rHBsAg上调了 CD8+ T细胞表面的IL-12Rβ1和IL-12Rβ2的表达。