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研究目的诱导pGEX4T-PorB原核表达载体,使其在宿主菌E. coliBL21(DE3)中实现高水平表达,并纯化PorB蛋白,通过Western印迹初步鉴定PorB蛋白的抗原性,为进一步研究其抗原性、免疫保护性及免疫动物模型提供科学依据。研究方法1. pGEX4T-PorB原核表达载体的诱导和检测：用异丙基-p-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导本实验室己构建的pGEX-4T-PorB重组质粒,摸索其最佳诱导的条件,并用SDS-PAGE技术检测重组蛋白表达情况。2.纯化PorB蛋白：经SDS-PAGE技术检测结果显示,pGEX4T-PorB融合蛋白以包涵体的形式表达。因此本实验要纯化包涵体,主要方法为分别用反复冻融后的超声处理法和化学处理法去裂解菌体,将裂解的菌体纯化洗涤,其中包括用TritonX-100提取纯化包涵体和用不同浓度的尿素提取纯化包涵体,通过调整洗涤纯化的条件使纯化出的PorB蛋白纯度提高,然后把经洗涤纯化的包涵体溶解,根据SDS-PAGE技术检测结果分析其溶解程度,充分溶解,则进行下一步的复性处理及纯化,不能充分溶解,则用切胶纯化和切胶透析纯化的方法纯化PorB蛋白。3. Western印迹初步鉴定了PorB蛋白的抗原性：在Western印迹鉴定的过程中,一抗、二抗的浓度会影响Western检测效果,出现非特异性条带,而适合的抗体浓度会减少非特异性条带的产生,故本实验应调整摸索一抗、二抗的的最佳浓度。结果1.在本实验室已摸索的IPTG终浓度为1.0mmol/L和温度为37℃的基础上,分别以不同时间诱导表达pGEX4T-PorB重组蛋白,发现在诱导5h后的pGEX4T-PorB表达产物沉淀在56KDa位置高水平表达并趋于饱和。2.根据SDS-PAGE电泳分析结果显示：经诱导含pGEX4T-PorB的大肠杆菌诱导表达产物的沉淀在56KDa位置出现预期大小的目的条带,而经诱导的含pGEX4T-PorB的大肠杆菌诱导表达产物的上清在中含量很少,由此确定PorB融合蛋白为包涵体性表达。3.通过SDS-PAGE电泳分析；通过调整洗涤纯化的条件得到了纯度较高的PorB蛋白,分子量约56kDa。在不能充分溶解的情况下,分别用切胶纯化和切胶透析纯化的方法纯化出了高纯度的PorB蛋白,分子量约56kDa。4.通过Western印迹初步鉴定了PorB蛋白的抗原性,并摸索抗体浓度为一抗1：5000；二抗1：500。结论通过优化诱导条件,成功诱导了pGEX4T-PorB融合蛋白的高水平表达,确定了PorB融合蛋白为包涵体性表达,以包涵体的形式纯化出了高纯度的PorB蛋白,并通过Western印迹初步鉴定了PorB蛋白的抗原性,本实验为进一步研究PorB蛋白的生物活性,抗原性、免疫保护性、和淋球菌致病机制提供实验和理论依据。