颌面部骨缺损主要由外伤、肿瘤、先天畸形等引起,它不仅会造成颜面畸形,还可引起语言、咀嚼、呼吸等功能障碍,对患者的生理和心理等各方面都会造成不良的影响。因此如何在修复骨缺损的同时兼顾功能与美观,是人们不断研究改进的目标。传统的骨缺损修复方法有人工骨移植、自体骨移植、同种异体骨移植等,然而这些方法都有各自的弊端。为克服这些弊端而构建的组织工程骨为骨缺损的修复提供了一个新的方法。骨组织工程主要由种子细胞、细胞外基质材料以及生长和分化因子这三个基本的生物学因素构成,其中最基本、最核心的就是种子细胞的选择,它是组织工程活性成分的主要来源。骨组织工程中理想的种子细胞必须具备可以定向分化为成骨细胞的能力,而且应来源广泛,取材方便,对机体损伤小并且移植后免疫排斥反应轻。目前,应用最广泛的是人骨髓间充质干细胞(human marrow-derived mesenchymal stem cells, hMSCs),其具有较强的成骨分化潜能,源于自体,取材方便,自我更新能力强,而且进行移植时不存在免疫排斥反应。因此,进一步研究MSCs的成骨分化机制将有助于hMSCs在骨组织工程中的临床应用。目前,对间充质干细胞成骨分化的分子调控机制的研究已经有了显著的进展,其受多种因素调控,如生长因子(Wnt家族、骨形态发生蛋白家族)、转录因子(β-catenin、Runx2)和miRNA等。而最近的研究发现一种新的DNA序列以外的调控机制即长链非编码RNA(long noncoding RNA, lncRNA)也影响间充质干细胞的成骨分化。lncRNA是一类转录本长度超过200nt的RNA分子,它们并不直接参与蛋白质的编码,起初一直被认为是基因组转录的”噪音”,是转录过程中产生的副产物,并不具备生物学功能。但是近年来,随着基因芯片技术及RNA测序技术的广泛应用,越来越多的lncRNA被鉴定出来,并通过研究证实其具有复杂的生物学功能,在多个层面上参与细胞分化和个体发育等重要生命过程的调控。如研究显示lncRNA与神经元分化、肌分化、表皮分化、成脂分化等相关。虽然近年来对于lncRNA调控间充质干细胞成骨分化的研究也有少量报道,但是截至目前,对于hMSCs成骨分化过程中lncRNA的表达谱特征尚无文献报道。因此,本研究将首次采用人类lncRNA表达谱芯片检测技术对在hMSCs成骨分化前后发生差异表达的lncRNA进行筛选,并对其进行分析研究,为hMSCs成骨分化机制研究提供新的lncRNA靶点,从而为构建更理想的组织工程骨移植物提供新的理论基础。本实验将分为以下3个部分：第一章入骨髓间充质干细胞与成骨诱导分化细胞的培养及鉴定研究目的：人骨髓间充质干细胞是一种具有多向分化潜能的细胞,在体外分裂增殖能力强,可以在不同的诱导条件下分化为成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞、肌肉细胞、神经细胞、心肌细胞等,被认为是骨组织工程中重要的种子细胞。本实验通过体外培养人骨髓间充质干细胞,并利用间充质干细胞成骨分化培养基使其向成骨细胞方向分化后进行成骨分化鉴定,为后续lncRNA表达谱芯片检测实验做准备。研究方法：1.将购买的原代hMSCs进行扩增培养至P2代,并将P2代hMSCs在间充质干细胞成骨分化培养基中培养7、14、21天后,对其细胞形态进行观察。2.以hMSCs成骨诱导分化7天、14天、21天后的细胞作为实验组(分别记为D7、D14和D21),以成骨诱导分化前的hMSCs作为对照组(记为DO)。通过碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)染色及茜素红染色进行成骨分化的鉴定。3.对D0、D7、D14及D21组细胞样本进行细胞总RNA提取,然后对样本RNA进行质量鉴定。4.利用实时荧光定量PCR (RT-PCR)检测成骨特异性转录因子(Osterix、ALP、 OPN)表达情况来进行成骨分化的鉴定。研究结果：1.原代hMSCs传代培养至P2代,细胞生长状态良好,呈形态均一的长梭形。经成骨诱导培养后细胞形态由长梭形变为多角形,随着培养时间延长,细胞增殖加快,7天时可见细胞聚集成团,诱导14天及21天时可见到棕黑色的钙结节。2.P2代hMSCs进行ALP染色及茜素红染色,结果均为阴性。将成骨诱导7、14、21天后的细胞行ALP染色,胞质中呈现红色,提示ALP染色结果为阳性；行茜素红染色,可见红色的钙盐沉积,提示茜素红染色结果为阳性。3.D0、D7、D14、D21样本RNA的A260/A280值均为1.8-2.0,说明总RNA具有较高的纯度；RNA完整性：经甲醛变性胶电泳检测,RNA样品电泳条带清晰,28S：18S rRNA条带亮度大于或接近2：1,质量符合进一步RT-PCR实验及后续表达谱芯片实验要求。4.RT-PCR检测hMSCs成骨诱导分化前后Osterix、ALP、OPN的表达变化,结果显示与hMSCs成骨诱导分化前相比,成骨诱导分化后Osterix、ALP、OPN的表达明显增加,差异具有统计学意义(P<0.05)。第二章人骨髓间充质干细胞成骨分化前后差异表达lncRNA的筛选及验证研究目的：本实验通过lncRNA表达谱芯片检测技术筛选出hMSCs成骨分化前后差异表达的lncRNA表达谱特征,初步探讨了lncRNA在hMSCs成骨分化过程中的重要作用。但是基因芯片检测存在一定的假阳性率,必须通过其他的方式加以验证,因此我们从芯片检测结果中随机选取5个差异表达lncRNA(2个上调的lncRNA:ENST00000523786.1和ENST00000436715.1,3个下调的IncRNA: ENST00000532315.1、HIT000218960和ENST00000502125.2)进行实时荧光定量PCR检测,以进一步验证芯片结果的准确性。研究方法：1.D0、D7、D14及D21组细胞样本RNA质检合格后,进行体外扩增和荧光标记,将标记后的产物与Agilent公司人IncRNA V3.0芯片杂交过夜。使用Agilent芯片扫描仪对芯片进行扫描,得到杂交图片。使用Agilent Feature Extraction(v10.7)软件对杂交图片进行分析并提取数据(包括IncRNA及mRNA数据)。然后使用Agilent GeneSpring软件对数据进行归一化和差异分析(设定差异基因筛选标准为Fold Change不低于2倍)。2.随机选取5个差异表达IncRNA进行实时荧光定量PCR检测,验证芯片结果的准确性。研究结果：1.芯片检测结果发现与成骨诱导分化前的hMSCs相比,成骨诱导分化7天、14天、21天后表达上调超过2倍的IncRNA分别有923条、1393条、1338条；下调超过2倍的IncRNA分别有993条、3843条、3688条；表达上调超过2倍的mRNA分别有1462条、4093条、3354条；下调超过2倍的mRNA分别有953条、2236条、1923条。与成骨诱导分化前的hMSCs相比,成骨诱导分化7、14、21天过程中持续表达上调超过2倍的IncRNA有433条,下调超过2倍的IncRNA有232条；持续表达上调超过2倍的mRNA有956条,下调超过2倍的mRNA有229条。2.RT-PCR验证结果显示与DO组相比,ENST00000523786.1和ENST00000436715.1在D7、D14、D21组中表达明显上调(P<0.05)；ENST00000532315.1、HIT000218960和ENST00000502125.2在D7、D14、D21组中表达明显下调(P<0.05)。实时荧光定量PCR结果与芯片检测结果一致。第三章人骨髓间充质干细胞成骨分化前后差异表达lncRNA和mRNA的生物信息学分析研究目的：初步探讨hMSCs成骨诱导分化过程中持续差异表达的mRNA可能与哪些基因功能和生物学通路的改变相关。并对芯片筛选结果中表达差异较大的lncRNA附近300 kb区域蛋白编码基因进行分析,从而预测lncRNA作用的靶基因,这将有助于揭示一个新的受特定lncRNA分子调控的hMSCs成骨分化机制。研究方法：对hMSCs成骨诱导分化过程中持续差异表达的mRNA进行基因本体论(Gene Ontology, GO)和KEGG生物学通路分析(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes Pathway analysis)。并选取芯片筛选结果中表达差异较大的lncRNA,根据其序列信息并结合芯片检测结果中差异表达mRNA序列信息,对选取的lncRNA附近300 kb区域蛋白编码基因进行分析。研究结果：1.GO分析结果显示：在生物学进程(biological process, BP)方面,1MSCs成骨诱导分化过程中持续差异表达mRNA基因中有680个基因富集于生物学进程,其中富集评分最高的是system development这一生物学进程,含有差异表达基因217个。在细胞组件(cellular component, CC)方面,hMSCs成骨诱导分化过程中持续差异表达mRNA基因中有702个基因富集于细胞组件,其中富集评分最高的是extracellular matrix这一细胞组件,含有差异表达基因57个。在分子功能(molecular function, MF)方面,hMSCs成骨诱导分化过程中持续差异表达mRNA基因中有631个基因富集于分子功能,其中富集评分最高的是carbohydrate derivative binding这一分子功能,含有差异表达基因28个。2.KEGG分析结果显示：MSCs成骨诱导分化过程中持续差异表达mRNA基因中有427个基因富集于生物学通路,并主要富集于31个生物学通路,其中富集评分最高的是Complement and coagulation cascades这一生物学通路,含有差异表达基因21个。3.我们从芯片筛选结果中选取hMSCs成骨诱导分化过程中持续表达上调较大的lncRNA ENST00000585537.1及下调较大的lncRNA eHIT000015952,结合芯片筛选出的差异表达mRNA表达谱分析发现：lncRNA ENST00000585537.1位于第17号染色体,在其附近300kb区域内存在3个蛋白编码基因(MAP2K6、 TEKT1、ABCA5); lncRNA eHIT000015952位于第3号染色体,在其附近300kb区域内存在7个蛋白编码基因(如PAK2、MFI2、DLG1等)。全文结论：1.hMSCs在体外具有较强的成骨分化能力,在适当培养条件下可分化为成骨细胞。2.首次通过高通量lncRNA表达谱芯片检测技术筛选出hMSCs成骨诱导分化前后差异表达lncRNA的表达谱特征,并利用实时荧光定量PCR对部分差异表达lncRNA予以验证,证实了芯片结果的可靠性。3.GO分析：hMSCs成骨诱导分化过程中持续差异表达mRNA基因中有680个基因富集于生物学进程,有702个基因富集于细胞组件,有631个基因富集于分子功能。KEGG分析：hMSCs成骨诱导分化过程中持续差异表达mRNA基因中有427个基因富集于生物学通路,并主要富集于31个生物学通路。4.对部分差异表达lncRNA近蛋白编码基因进行生物信息学分析,提示差异表达的lncRNA在hMSCs成骨分化过程中可能作用的靶基因。5.为研究hMSCs成骨分化提供新的lncRNA靶点,从而为构建更理想的组织工程骨移植物提供新的理论基础。