上皮间质转换(Epithelial-Mesenchymal Transition,EMT)在肿瘤的发生与转移过程中发挥着重要的作用,它赋予肿瘤上皮细胞间质样的特性,使得肿瘤细胞具有更强的运动能力和侵袭能力。SNAIL是EMT转变过程中最重要的调控因子,在肿瘤的发生发展中发挥了关键的调节作用,因此它的表达受到转录水平、翻译水平和翻译后水平等多方面的精密调控。在翻译后水平,SNAIL主要受到泛素化的修饰。多聚泛素化调节了SNAIL通过泛素-蛋白酶体途径的降解。而具有底物特异性的E3泛素连接酶是调节SNAIL多聚泛素化与蛋白稳定性的关键因子。真核细胞拥有超过五百种E3连接酶负责蛋白质的多聚泛素化修饰,每个E3连接酶可调节多个蛋白质底物的泛素化,每个蛋白质底物也通常受到多个E3连接酶的调控。研究表明转录因子SNAIL在细胞中极不稳定,半衰期只有15分钟,因此泛素化调节是影响SNAIL在细胞内表达水平的一个重要因素。到目前为止,若干E3泛素连接酶已经被证实能够参与调节SNAIL的泛素化修饰和蛋白酶体途径降解,鉴于细胞内蛋白质泛素化修饰的多样性与复杂性,我们利用基于荧光素酶报告基因的方法筛选了E3连接酶siRNA文库,以期发现影响SNAIL泛素化修饰和蛋白酶体途径降解的新的E3连接酶。通过筛选文库,我们发现SOCS box家族E3泛素连接酶SPSB3调节了SNAIL的多聚泛素化和蛋白酶体降解。首先我们通过免疫共沉淀的实验方法证实了SPSB3和SNAIL之间存在着很强的相互作用,接着利用放线菌酮追踪实验以及泛素化实验证明了SPSB3能够特异性的识别并结合SNAIL,从而介导SNAIL的多聚泛素化和蛋白酶体途径降解。我们特别关注了SPSB3对于细胞功能的影响。由于SNAIL在肿瘤细胞中主要通过促进EMT的转变来促进肿瘤细胞的迁移和侵袭,我们选择了迁移能力比较强的人食管癌细胞系KYSE30,发现过表达SPSB3大大减弱了人食管癌细胞系KYSE30的侵袭和转移能力。在4T1细胞原位肺转移动物模型中,我们发现SPSB3的过表达能够逆转SNAIL导致的4T1细胞的原位肺转移。其次,考虑到SNAIL能够通过调节细胞干性影响肿瘤发生,我们在T24 H-Ras转化的永生化人乳腺上皮细胞MCFCA1a中过表达SPSB3来研究SPSB3介导的SNAIL泛素化降解对肿瘤发生的影响,发现SPSB3的表达确实降低了MCFCA1a细胞的克隆形成能力。为更加全面地探讨SPSB3对于体内功能的影响,我们将MCFCA1a以及过表达SPSB3的MCFCA1a细胞原位注射于裸鼠皮下,发现SPSB3的过表达减弱了肿瘤细胞的成瘤能力。总之,我们通过体内和体外实验证明了SPSB3能够通过降解SNAIL的方式降低肿瘤的发生和侵袭转移能力。随后,我们研究了SPSB3泛素化降解SNAIL的具体分子机制。我们将一系列的SNAIL的缺失突变体与SPSB3做免疫共沉淀实验,发现SNAIL的丝氨酸富集结构域SRD对于两者的相互作用至关重要。在SNAIL的SRD结构域含有6个丝氨酸位点。GSK3β通过调节SNAIL SRD结构域内6个丝氨酸位点的磷酸化调节了SPSB3对SNAIL的泛素化修饰。因此,SPSB3介导的SNAIL泛素化依赖于GSK3β调节的SNAIL磷酸化。此外我们发现TNFα作为影响SNAIL蛋白稳定性的上游信号参与调节了SPSB3的表达,因此TNFα至少部分通过降低SPSB3的表达来提高SNAIL的稳定性。最后,我们在组织标本中研究了SPSB3的表达情况,发现两者在组织标本中的表达成负相关。一方面,在食管癌的配对标本中,我们发现SPSB3在肿瘤组织中的表达明显低于对应的正常组织,而且SPSB3的表达与肿瘤的分化程度密切相关。另一方面,在卵巢癌组织芯片中,SPSB3和SNAIL的表达也呈现负相关的关系。食管癌以及卵巢癌组织标本中的结果,一定程度上反应了SPSB3与SNAIL之间的调节关系以及二者在肿瘤发生发展中的作用。总之,我们的研究从寻找新的调节SNAIL泛素化降解的E3连接酶出发,发现E3连接酶SPSB3依赖于GSK3β对SNAIL的磷酸化介导SNAIL的泛素化修饰和蛋白酶体途径降解。SPSB3通过调节SNAIL的泛素化降解抑制了肿瘤的发生发展和侵袭转移。我们的工作一定程度上揭示了肿瘤发生发展和侵袭转移的具体机制,为肿瘤的临床治疗提供了理论依据。