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光学活性手性醇已被公认为合成精细化学品和药物的关键手性中间体,羰基还原酶催化还原潜手性羰基化合物具有高化学选择性、对映体选择性和区域选择性,是制备手性醇的单一对映异构体的有效方法。然而,工业中使用的大部分潜手性酮在结构上是复杂的,比如芳香酮、酮酯和杂环酮,底物分子大小引起的酶活性缺陷仍然是酶促还原酮的一个挑战。因此,有必要开发可催化还原具有庞大基团的底物的酶,用于生产高光学纯度的手性醇。本研究开发和构建了大分子酮还原酶工具箱,尝试以多种芳香酮、酮酯、杂环酮为底物,考察各酶的催化性能和立体选择性,实现了多种医药中间体的高立体选择性制备,并探究了 2-氧代-4-苯基丁酸乙酯(OPBE)和1-苄基-3-吡咯烷酮不对称转化反应的影响因素,具体研究内容如下:(1)通过基因挖掘获得新型醛酮还原酶,包括来源于Candida albicans的CaCR、来源于Saccharomyces cerevisiae ScCR 以及来源于Kluyveramyces marianus的 KmCR,同时挖掘到来源于C.parapsilosis的醛酮还原酶CPR-C1和CPR-C2。构建重组大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)/pET-28a(+)-CaCR、E.coli BL21(DE3)/pET-28a(+)-ScCR、E.coli BL21(DE3)/pET-28a(+)-KmCR,通过IPTG诱导使目的蛋白活性表达,构建大分子酮还原酶工具箱。除此之外,羰基还原酶RCR的两种突变体F285A/W286A和W116A,也作为本研究的大分子酮还原酶工具箱中的成员。通过对各羰基还原酶进行Ni亲和层析柱纯化,获得SDS-PAGE显示单一条带的纯酶。(2)以芳香酮、酮酯和杂环酮类化合物作为底物,考察大分子酮还原酶工具箱的催化性能。结果显示,各羰基还原酶均对一到几种大分子底物具有活性,与其他酶相比,ScCR显示出更广泛的底物特异性。大部分酶都具有潜在催化还原苯甲酰甲酸乙酯的能力。对与底物亲和力相关的Kn值分析,发现酶作用大分子底物的催化规律。(3)探究重组羰基还原酶的立体选择性,结果显示酶促反应生成的手性醇构型与其在工业应用上的需求相一致,以大于99%的对映体过量值生成(R)-扁桃酸甲酯、(R)-扁桃酸乙酯、(R)-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯((R)-HPBE)、(5)-3-羟基-3-苯基丙酸乙酯以及(5)-1-苄基-3-吡咯烷醇。(4)分别探究反应体系组成和条件对OPBE、1-苄基-3-吡咯烷酮不对称转化反应的影响。结果显示以F285A/W286A催化还原OPBE时,当pH 7.0,反应温度30℃,3.5%(v.v-1)异丙醇作助溶剂,加入1 g.L-1底物,反应12h时,产率为80.3%,对映体过量值大于99%。而以W116A催化还原1-苄基-3-吡咯烷酮时,当加入60%(v·v-1)异丙醇、0.5 g.L-1底物时,产率为75.2%,对映体过量值大于99%。