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引言乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤,且发病率逐年上升,复发转移是乳腺癌治疗效果不佳的主要原因,阻断其复发转移是目前乳腺癌治疗的重点。90%以上的上皮细胞恶性肿瘤在发生侵袭与转移过程中发生了上皮细胞间质转化（epithelial-mesenchymal transitions,EMT）,例如肺癌、乳腺癌、结肠癌及肝癌等。EMT的研究对进一步揭示肿瘤细胞侵袭、转移的机制及寻找抗肿瘤治疗靶点提供了新的思路。早期生长应答因子4（Early growth response factor 4,EGR-4）是EGR蛋白家族成员之一,编码锌指蛋白转录因子。EGR-4是促进细胞从静止进入细胞周期所必需的因子,参与调节细胞分化,与部分肿瘤性疾病发生发展相关。有研究表明EGR蛋白家族与EMT及肿瘤的发生发展有着密切的相关性!然而EGR4在乳腺癌的作用,目前仍缺乏系统全面的相关研究!目的探讨EGR-4在乳腺癌中的表达及其与乳腺癌患者临床参数和预后的关系;证明EGR-4对乳腺癌细胞增殖、迁移及侵袭的影响和对其发生EMT的影响作用;阐述EGR-4诱导乳腺癌细胞EMT发生的具体分子机制。方法本研究分三部分:第一部分选取2014年1月至2014年12月期间于江苏省徐州市肿瘤医院乳腺科经病理确诊的女性乳腺癌患者100例,收集其癌组织标本及配对正常癌旁组织。同时体外培养人乳腺癌BT474、SKBr-3、ZR-75-30、MCF-7、MDA-MB-453、MDA-MB-231细胞以及正常乳腺上皮细胞,逆转录-聚合酶链反应（Reverse transcription-Polymerase Chain Reaction,RT-PCR）法检测EGR-4 m RNA水平;蛋白质印迹（Western-blotting WB）和免疫组织化学（Immunohistochemistry,IHC）检测EGR-4表达情况;临床资料包括患者肿瘤大小,淋巴结转移,Her-2状态,组织学分级以及复发转移情况。logistic多元回归分析EGR-4表达与患者病理特征的相关性,logistic多元回归分析EGR-4的表达与预后的相关性。第二部分体外培养乳腺癌细胞系MCF-7细胞和SKBr-3细胞,应用质粒及小片段干扰核糖核酸（small interfering RNA,si RNA）构建EGR-4过表达和低表达的乳腺癌细胞系（EGR-4及si EGR-4）。RT-PCR和WB实验检测EGR-4表达情况,CCK-8、平板克隆实验检测EGR-4表达变化后乳腺癌细胞的活性及增殖能力变化;细胞划痕实验检测EGR-4表达变化后乳腺癌细胞迁移能力变化;Transwell小室检测EGR-4表达变化后乳腺癌细胞侵袭能力变化。应用细胞免疫荧光实验、WB实验检测EGR-4表达变化后乳腺癌细胞中E-cadherin、Vimentin、snail等蛋白的表达变化,评估乳腺癌细胞EMT的发生情况。第三部分应用免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation,Co-IP）技术及液质联质谱分析（liquid chromatography-mass spectrometry,LC-MS）寻找EGR-4特异结合的蛋白。应用WB和RT-PCR实验检测目标蛋白及EMT发生过程中关键蛋白的变化情况。结果乳腺癌组织及细胞中EGR-4表达上调（P<0.05）;且EGR-4的表达与患者乳腺癌的组织学分级呈正相关。EGR-4表达与患者淋巴结转移、人表皮生长因子受体2（Human epidermalgrowth factor receptor-2,Her-2）状态、复发转移等情况相关;存在局部复发、远处转移的患者较早期患者EGR-4表达水平更高;EGR-4低表达患者生存率高于高表达患者。将质粒、si EGR-4转染入乳腺癌细胞系后,成功过表达/干扰了乳腺癌细胞系中EGR-4。过表达EGR-4促进乳腺癌细胞增殖、迁移、侵袭能力,CCK-8检测结果显示,转染EGR-4质粒的乳腺癌细胞的细胞活力较转染空载体组（vector）细胞增高;平板克隆实验结果显示,转染EGR-4质粒的乳腺癌细胞集落数明显高于转染空载体组细胞;细胞划痕实验结果显示,转染EGR-4质粒的乳腺癌细胞愈合速度较转染空载体组细胞明显增快;transwell小室结果显示,转染EGR-4质粒的乳腺癌细胞侵袭能力较转染空载体组细胞明显增快。干扰EGR-4抑制乳腺癌细胞增殖、迁移、侵袭,CCK-8检测结果显示,转染si EGR-4的乳腺癌细胞活力较对照组（转染si NC）细胞明显减弱;平板克隆实验结果显示,转染si EGR-4的乳腺癌细胞集落数明显少于转染si NC组细胞;细胞划痕实验结果显示,转染si EGR-4的乳腺癌细胞划痕愈合速度转染si NC组明显减慢;transwell小室结果显示,转染si EGR-4的乳腺癌细胞侵袭能力较转染si NC组明显减慢。EGR-4诱导EMT的发生,细胞免疫荧光结果显示,转染EGR-4质粒的乳腺癌细胞中E-cadherin的表达较转染空载体组细胞明显降低,而Vimentin蛋白的表达明显增多;转染si EGR-4的乳腺癌细胞中E-cadherin的表达较转染si NC的乳腺癌细胞明显上升,但蛋白Vimentin的表达明显下降。WB检测结果显示,转染EGR-4质粒的乳腺癌细胞中E-cadherin的表达较转染空载体组细胞明显下降,但N-cadherin和Snail蛋白的表达明显增多;转染si EGR-4的乳腺癌细胞中E-cadherin的表达较转染si NC的乳腺癌细胞明显上升,但N-cadherin和Snail蛋白表达明显下降。应用EMT抑制剂抑制乳腺癌细胞EMT的发生,过表达/干扰乳腺癌细胞中EGR-4,乳腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力与对照组相比无明显比变化。Co-IP及质谱分析方法检测发现,EGR-4与成纤维细胞分泌的转化生长因子-β（Transforming growth factor-β,TGF-β）存在相互作用。反向Co-IP实验证实TGF-β1可特异结合EGR-4。WB、PCR结果显示,过表达EGR-4,TGF-β1蛋白和m RNA水平表达无明显变化;ELISA结果显示,过表达EGR-4,TGF-β1分泌增加。WB、PCR结果显示,干扰EGR-4表达,TGF-β1蛋白和m RNA水平表达无明显变化;ELISA示,干扰EGR-4表达,TGF-β1分泌减少。WB结果示,过表达EGR-4,乳腺癌细胞中Smad蛋白表达增多,E-cad蛋白表达减少,N-cad及Snail蛋白表达增多,提示EGR-4通过TGF-β/Smad通路诱导EMT发生。结论EGR-4表达与乳腺癌的进展相关,且可预测患者预后,EGR-4表达水平越高,患者预后越差。过表达EGR-4促进乳腺癌细胞增殖、迁移、侵袭能力及EMT的发生。干扰EGR-4表达抑制乳腺癌细胞增殖、迁移、侵袭能力及EMT的发生。EGR-4通过诱导EMT发生促进乳腺癌细胞增殖、迁移和侵袭能力。EGR-4通过与TGF-β1相互作用诱导EMT发生促进乳腺癌细胞增殖、迁移和侵袭能力。