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赭曲霉毒素A(ochratoxin A,OTA)是一种由青霉素属和曲霉属的某些菌种产生的真菌毒素,主要污染谷物及其制品,具有神经毒性、肝肾毒性等多种毒性作用。建立谷物中OTA污染残留的有效监控和检测方法是防止其造成食品安全问题的重要手段。目前,OTA的检测方法主要包括高校液相色谱法、液相色谱-质谱联用、免疫学分析法等,其中免疫学分析法具有快速、灵敏等特点,适合大批量样本的筛查。纳米抗体(Nanobody,Nb)是目前已知的最小抗原结合单位,源自驼源动物体内重链抗体的重链可变区,具有易表达、水溶性好、稳定性高等性质,目前已广泛应用于医学诊断、疾病治疗、食品安全分析等领域。本研究制备了抗OTA Nb,并对其检测性能和作用机理进行了研究。主要研究结果如下:1、OTA Nb噬菌体展示文库的构建、淘选及应用1.1成功构建了一个库容为2×107 cfu且多样性良好的OTA Nb初始文库,经辅助噬菌体救援后获得滴度为4×1012 cfu/m L的抗OTA Nb噬菌体展示文库,结合Gly-HCl洗脱和标准品竞争洗脱两种方式,进行四轮亲和淘选,经鉴定及DNA测序分析,共获得4种独特的Nb序列。1.2建立了基于噬菌体VHH-28超灵敏检测谷物中OTA的噬菌体RT-IPCR,LOD为3.7 fg/m L,线性范围0.01-1000 pg/m L,与OTB的交叉反应率为3.5%,OTA加标回收率80-126%,实际谷物样本的RT-IPCR检测结果与商业OTA ELISA试剂盒的检测结果相关性良好。2、OTA Nb的原核表达、活性分析及应用2.1成功制备了四种OTA纳米抗体Nb15、28、32、36,间接竞争ELISA测得IC50分别为160.34、0.64、17.60、286.15 ng/m L。四种Nb的热稳定性良好,95℃加热5 min和90℃加热60 min后保留了至少50%和25%的抗原结合能力。采用Bio-layer interferometry生物传感器测定了Nb的平衡解离常数,同时采用同源建模和分子对接技术研究了Nb与OTA的相互作用机理,结果表明Nb与OTA之间的相互作用力主要包括氢键和疏水作用,且亲和力与灵敏度呈正相关性。2.2建立了基于Nb28检测谷物中OTA的Nb-ELISA,IC50 0.64 ng/m L,线性范围0.27-1.47 ng/m L,LOD 0.16 ng/m L,与OTB的交叉反应率为10.4%,批内加标回收率81-108%,批内变异系数1-9%,批间加标回收率为85-99%,批间变异系数为5-6%。实际谷物样本的Nb-ELISA检测结果与商业OTA ELISA试剂盒的检测结果相关性良好。3、OTA Nb-AP融合蛋白的原核表达、活性分析及应用成功构制备了Nb28-AP融合蛋白,该融合蛋白仍保留良好的抗原结合能力和碱性磷酸酶活性。以Nb28-AP融合蛋白为检测探针,建立了检测谷物中OTA的dc-FEIA,IC50 0.13 ng/m L,线性范围0.06-0.43 ng/m L,LOD 0.04 ng/m L。与其它常见真菌毒素未见交叉反应,批内加标回收率72-121%,批内变异系数分别为2-13%,批间加标回收率73-109%,批间变异系数5-9%。实际谷物样本的检测结果与LC-MS/MS的检测结果相关性良好。