甘蓝耐铝基因MATE和ALMT克隆与功能验证

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酸性土壤是限制作物生产的主要因子,能够降低陆地生产产量的25%。酸性土壤中(pH<5.0),铝主要以A13+单体存在,酸性土壤中大量铝的积累限制植物根的伸长和功能。在很多抗铝植物中,铝刺激根尖有机酸(如苹果酸和柠檬酸)的分泌被认为是植物耐铝的一个重要机制,苹果酸和柠檬酸的分泌分别由苹果酸通道蛋白(Al-activated malate transporter, ALMT)和柠檬酸通道蛋白(multidrug and toxic compound extrusion, MATE)控制。通过转基因技术可以显著提高作物的抗性,从而增加作物的产量。甘蓝(Brassica oleracea)是世界上种植最广的蔬菜作物之一。本研究以甘蓝为材料,分离得到ALMT和MATE的同源基因BoALMT1(基因序列号:KF322104)和BoMATE(基因序列号:KF031944),并通过对BoALMT1和BoMATE的功能分析发现,它们能够提高拟南芥的抗铝性。结果如下:1.从甘蓝中克隆了BoMATE基因的cDNA序列。测序结果表明其全长为1554bp,推断其编码517个氨基酸。蛋白序列与小麦TaMATE蛋白相似性为57%;与高粱SbMATE蛋白相似性为51%;与拟南芥AtMATE蛋白相似性最大,达到89%。与其他柠檬酸转运蛋白相似,BoMATE蛋白含有12个跨膜域和一个在第二和第三跨膜域之间的高度保守氨基酸序列。进化树分析发现BoMATE蛋白与拟南芥AtMATE蛋白的亲缘关系最近。2.在爪蟾卵母细胞中过表达BoMATE基因发现,过表达卵母细胞比正常卵母细胞有更强的14C标记的柠檬酸外排活性。电生理和SIET分析过表达爪蟾卵母细胞发现BoMATE蛋白能够被铝激活。3.实时荧光定量PCR (qPCR)分析表明BoMATE基因在根中表达量要高于地上部分,铝的处理能够提高BoMATE基因在根中的表达量。铝能够特异性诱导BoMATE基因在根中的表达。BoMATE基因的表达量不随时间和铝浓度的变化而变化。用铝处理甘蓝发现,根分泌柠檬酸量随处理时间延长而增加。亚细胞定位发现BoMATE-GFP的融合蛋白定位在洋葱表皮细胞的细胞膜上。4. BoMATE转基因拟南芥在柠檬酸分泌量和根伸长方面都显著高于对照植株。另外,在有铝条件下转基因拟南芥根的伸长区比对照植株钾离子外排更低和氢离子外排更高。5.从甘蓝中克隆BoALMT1基因的cDNA序列。测序结果表明其全长为1497bp,推断其编码498个氨基酸。蛋白序列与小麦TaALMT1蛋白相似性为33%;与拟南芥AtALMT1蛋白相似性为73%;与油菜BnALMT1蛋白相似性最大,达到99%。与其他苹果酸蛋白相似,BoALMT1含有5个跨膜域。进化树分析发现BoALMT1蛋白与油菜BnALMT1蛋白的亲缘关系最近。6.实时荧光定量PCR (qPCR)分析表明BoALMT1基因在根中表达量要高于地上部分,铝的处理能够提高BoALMT1基因在根中的表达量。铝能够特异性诱导BoALMT1基因在根中的表达。BoALMT1基因的表达量不随时间和铝浓度的变化而变化。亚细胞定位发现BoALMT1-GFP的融合蛋白定位在洋葱表皮细胞的细胞膜上。7.异源表达BoALMT1基因于爪蟾卵母细胞中,运用SIET分析发现BoALMT1蛋白具有抗铝性。过表达BoALMT1基因在拟南芥中可以增加植株在铝胁迫下的抗性和苹果酸的外排。
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