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研究目的:以高龄不孕症再次行IVF-ET患者(肾阴虚肝郁血瘀型)为观察对象,研究中医药多途径联合干预的临床助孕疗效;并通过建立病证结合模型大鼠,研究补肾活血方导法改善肾虚血瘀型-卵巢储备功能下降(DOR)模型大鼠卵巢功能的具体机制。研究方法:1.临床研究:采用双向性队列研究方法,共纳入高龄(符合波塞冬人群分类的第二或三类)再次IVF-ET患者(肾阴虚肝郁血瘀型)121例。治疗组采用中医药多途径(滋肾助孕方口服+导法+耳穴贴敷法)干预,共61例;对照组采用脱氢表雄酮(DHEA)口服治疗,共60例,均治疗三个月经周期。治疗后通过比较两组自然妊娠率、中医证候积分,FSH、LH、FSH/LH、E2值,促性腺激素(Gn)启动量/总量/使用天数,胚胎质量相关指标(获卵数、成熟卵数、成熟卵率、受精数、受精率、正常受精数、正常受精率、优胚数、优胚率)及妊娠结局(临床妊娠率、生化妊娠率、异位妊娠率、早期流产率)等指标变化。2.实验研究:选取SPF级6～7周龄SD雌性未孕大鼠,雷公藤多苷+肾上腺素联合复制肾虚血瘀型-DOR病证结合模型大鼠,随机分为空白组、模型组、补肾活血方导法高/中/低剂量组、中药对照组、西药对照组共7组,按实验要求进行干预,观察各组大鼠一般情况,卵巢湿重、卵巢脏器指数,HE染色观察卵巢组织形态病理改变,Elisa法测定卵巢激素水平(FSH、AMH、INHB、E2值)、凝血功能,免疫组化法检测BMP-15蛋白表达,q-PCR法测定TGF-β1、smad3、p38MAPK的m RNA表达。研究结果:1.临床研究:(1)治疗组自然妊娠率8.19%(5/61),临床妊娠率33.33%(12/36),生化妊娠率5.55%(2/36),早期流产率16.67%(2/12),异位妊娠率0%(0/36),治疗高龄再次IVF-ET的复常率27.86%(17/61),优于对照组(P<0.05);(2)治疗组改善月经周期或经量异常情况、中医主/次症积分、单项症状消失率、中医证候总有效率优于对照组(P<0.05);(3)治疗组组内比较可降低FSH、FSH/LH、升高LH(P<0.05),且改善E2、FSH/LH值优于对照组(P<0.05);(4)治疗组组内比较可降低Gn启动量、降低Gn总量(P<0.05),与对照组比较无差异(P>0.05);(5)治疗组组内比较能增加获卵数、成熟卵子数、受精数(P<0.05),治疗组改善获卵数、优胚数优于对照组(P<0.05);(6)两组不良反应发生率均为0%,安全分级一级,两种干预方式均安全。2.实验研究:(1)与空白组比较,模型组大鼠一般情况差,大鼠卵巢湿重及卵巢脏器指数下降(P<0.05),各级卵泡明显减少、闭锁卵泡增加(P<0.05),AMH、INH-B、E2值降低(P<0.05),FSH值升高(P<0.05),APTT、PT、TT下降(P<0.05),FIB上升(P<0.05);(2)补肾活血方导法中剂量组、西药对照组的各级卵泡数增加、闭锁卵泡减少、大鼠卵巢湿重及卵巢脏器指数增加(P<0.05);(3)补肾活血方导法中剂量组FIB值降低、APTT、PT、TT值升高(P<0.05),除中低组外,其余各组AMH表达量升高;各组INH-B、E2表达量升高,FSH表达量降低(P<0.05)。(4)补肾活血方导法中/高剂量组、中药对照组、西对组能上调TGF-β1、Smad3、p38MAPK的m RNA表达(P<0.05),补肾活血方导法高/中/低剂量组、西药/中药对照组大鼠卵巢组织BMP15蛋白含量升高(P<0.05)。(5)TGF-β1/smad3、p38MAPK信号通路与AMH、INH-B、E2均具有正相关,与FSH均具有负相关。但从相关系数分析,TGF-β1与AMH、INH-B、FSH、E2呈强相关;smad3与AMH、INH-B呈极强相关,与FSH、E2呈强相关;p38MAPK与AMH、INH-B、FSH、E2呈强相关。研究结论:1.临床研究:(1)中医药多途径治疗高龄再次IVF-ET患者,能改善患者肾阴虚肝郁血瘀症状、降低中医证候积分、提高患者自然妊娠率;(2),通过改善生殖内分泌水平,提高卵巢反应性,降低Gn用量,改善胚胎质量,增加临床妊娠率,降低流产率等实现中医药多途径干预助孕疗效。2.实验研究:(1)雷公藤多苷联合肾上腺素成功复制肾虚血瘀型-DOR大鼠模型;(2)补肾活血方导法能改善模型大鼠一般状况、卵巢湿重、生殖内分泌水平、凝血功能;正向调节BMP-15蛋白、TGF-β1、smad3、p38MAPKm RNA的表达,其效果优于DHEA,但所设立的高、中、低剂量,并未形成量效依赖关系,但补肾活血方导法中剂量效果最为稳定;(3)补肾活血方导法改善肾虚血瘀型-DOR模型大鼠卵巢功能,可能是通过调控TGF-β/smad3和p38MAPK两条信号通路实现的。