【摘 要】
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杨树作为重要的经济树种和模式植物,其木材被广泛应用于人类生产和生活的各个方面,具有重要的经济价值。木材从结构上来说主要是茎的次生木质部组成,木质素和纤维素是其主要的组成成分。理解和研究植物次生壁生物合成的机理,不仅对植物次生发育的基础研究具有重要的科学意义,而且选育符合人类生产和生活所需的林木新品种打下坚实的基础。植物LIM蛋白家族一般含有2个被40~50个氨基酸残基分隔的LIM结构域(Lin-I
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杨树作为重要的经济树种和模式植物,其木材被广泛应用于人类生产和生活的各个方面,具有重要的经济价值。木材从结构上来说主要是茎的次生木质部组成,木质素和纤维素是其主要的组成成分。理解和研究植物次生壁生物合成的机理,不仅对植物次生发育的基础研究具有重要的科学意义,而且选育符合人类生产和生活所需的林木新品种打下坚实的基础。植物LIM蛋白家族一般含有2个被40~50个氨基酸残基分隔的LIM结构域(Lin-Isl-Mec domain),其分子结构中具有一个或多个锌指结构。LIM蛋白的主要特点是能在不同发育时期以及不同发育类型的细胞中,通过锌指结构影响蛋白质-蛋白质之间的相互作用,造成结构蛋白、激酶、转录因子等多种蛋白的生物学活性发生变化,植物LIM蛋白可作为木质素生物合成和肌动蛋白转录因子的结合蛋白。因此,研究LIM蛋白对细胞的生长与发育具有重要意义。本论文通过对杨树PtLIM1进行系统进化树分析和组织表达分析,并结合前人的研究报道,推测PtLIM1基因可能参与植物次生壁的形成。并利用组织切片、遗传学、分子生物学等研究手段对其功能进行深入研究,探究PtLIM1表达量变化对木材材性的影响,以期为速生树种木材材性的改良提供分子理论技术支撑。主要研究结果如下:(1)PtLIM1基因的克隆及序列分析从毛果杨木质部中克隆出长度为621 bp的CDS序列,其编码206个氨基酸。编码的蛋白中含有2个锌指蛋白结构域。通过对该基因进行系统进化分析,毛果杨PtLIM1基因与拟南芥At PLIM2b基因亲缘关系较近,主要在成熟的花粉中表达,其次在应拉木中高表达,对次生壁木质素和纤维素的合成发挥作用。(2)PtLIM1的表达特异性分析PtLIM1在木质部中表达量最高,韧皮部表达量次之,在叶片中表达水平较低,在根中不表达。推测其可能参与次生壁的生物合成。次生壁的合成过程比较复杂,受到激素、信号分子、转录分子在时间和空间的协同调控。利用一定浓度赤霉素、生长素、乙烯利、脱落酸、油菜素内酯进行处理,PtLIM1基因的表达量发生不同程度的上调,说明激素可能通过影响基因的表达,进而影响木质素和纤维素的合成。(3)PtLIM1在转基因山新杨中的功能分析构建了35S:PtLIM1的过表达载体,通过农杆菌介导的转化方法转化山新杨叶片。将初步Kan抗性筛选得到的转基因苗提取RNA进行定量PCR鉴定基因表达量的变化,获得转基因的阳性植株。PtLIM1过表达转基因山新杨植株的茎顶端变细,生物量降低。茎组织切片显示,过表达PtLIM1基因导致植株木质部区域变窄,髓心部分变大,其次对木质素和纤维素含量的测定,木质素含量降低,纤维素含量增加。由此可以得出PtLIM1负调控杨树次生壁中木质素的形成,正调控纤维素的形成。对温室生长3个月的PtLIM1过表达转基因植株进行定量PCR检测发现PtLIM1木质素通路关键酶基因的表达水平降低,纤维素合成通路关键酶基因的表达量上调。由此我们可以得出PtLIM1通过调控木质素和纤维素通路关键酶的表达调控次生壁物质的合成。PtLIM1基因的功能验证完善次生壁形成的转录调控网络,为实现精准的人工调控和林木育种工作打下了坚实的基础。
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