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目的：
OA特征是软骨退化，骨硬化，关节中的低度炎症等，最终引起关节的炎症反应和结构损伤，从而诱导软骨破坏。软骨负责维持细胞基质代谢的稳态平衡。然而，损伤会使软骨细胞功能发生障碍。因此，保护软骨细胞质量和改善软骨细胞功能成为治疗OA的有效手段。
软骨发生病变时，线粒体会发生损伤，尽管糖酵解能力增加，但每个细胞的线粒体数量减少，PGC-1α在OA软骨中表达会降低，导致线粒体的功能失常可产生大量活性氧簇(ROS)，这种氧化应激压力与OA等组织变性疾病密切相关，其增加的ROS可通过损伤胶原与蛋白聚糖、活化基质外金属蛋白酶而促进软骨变性，而AMPK的活化对软骨细胞分化至肥大表型的过程亦发挥着抑制作用。另外，AMPK通常被认为是细胞能量稳态的必要调节者，AMPK使PGC-1α磷酸化，进一步触发SIRT1介导PGC-1α乙酰化。在软骨细胞中，AMPK通过激活PGC-1α可抑制氧化应激、多种炎症反应。
竹节参皂苷Ⅳα(ChikusetsusaponinIVα，CHS)具有多种药理特性，虽然CHS是一种良好的天然抗氧化剂和抗炎小分子药物，但在软骨细胞和骨关节炎中尚未得到研究。本研究旨在探讨CHS对软骨细胞线粒体功能障碍、氧化应激和炎症的影响。用IL-1β刺激软骨细胞，模拟骨关节炎的发病机制。CHS可维持炎性因子刺激时受损软骨细胞AMPK的活性，在完成研究CHS在保护OA软骨细胞中的精确作用后，通过促进线粒体生物合成的AMPK/SIRT1/PGC-1α信号途径，改善OA软骨细胞线粒体功能与氧化应激，CHS在抑制OA软骨细胞向肥大表型转化的分子机制也涉及AMPK/SIRT1/PGC-1α途径。因此本研究明确CHS→AMPK/SIRT1/PGC-1α→线粒体能量代谢/肥大表型→软骨细胞功能的治疗OA的新机制，为精确理解骨关节炎靶向治疗提供重要临床应用价值。
方法及结果：
(1)CHS是一种良好的天然抗炎小分子药物，但在软骨细胞和骨关节炎中的应用尚未得到研究。因此，我们首先对软骨细胞进行了IL-1β、CHS的毒性试验。细胞活力测定发现，用100ng/mlIL-1β、50μMCHS处理的软骨细胞没有明显降低细胞活力。因此，我们在接下来的实验中分别使用了100ng/mlIL-1β、50μMCHS处理。分别采用IL-1β作为OA刺激剂制备软骨细胞体外模型，依据CHS剂量梯度对小鼠原代软骨细胞活率的影响，选择CHS最适剂量梯度及作用时间。结果表明CHS增强AMPK/SIRT1/PGC-1α的表达。基于CHS的最适剂量及作用时间，检测AMPKα1/2、β1/2的蛋白表达及AMPKα1/2磷酸化水平，结果证明CHS对OA软骨细胞AMPK活性的保护作用。
(2)由于骨关节炎软骨细胞存在线粒体功能障碍、损伤和合成缺陷，我们检测了CHS处理的软骨细胞的线粒体膜电位。采用IL-1β刺激诱导线粒体功能障碍。与对照组相比，IL-1β刺激(Model组)24h可显著降低线粒体膜动作电位。然而，CHS治疗可显著减轻IL-1β抑制的线粒体功能障碍，表现为线粒体膜电位改善。AMPK抑制剂化合物C(Compound C，Cc)的使用阻断了CHS治疗的缓解作用。这些结果表明，CHS可能通过AMPK/SIRT1/PGC-1α信号通路减轻IL-1β诱导的软骨细胞线粒体功能障碍。
(3)为了研究CHS是否也能减轻氧化应激，我们测定了软骨细胞中活性氧(ROS)的形成。结果表明IL-1β刺激可增加软骨细胞的ROS形成。然而，CHS治疗显著减轻了IL-1β诱导的氧化应激，显著减少了软骨细胞的ROS形成。此外，Cc的使用阻断了CHS治疗效果。这些结果表明，CHS可能通过AMPK/SIRT1/PGC-1α信号通路改善IL-1β诱导的软骨细胞氧化应激。
(4)为了确定CHS在治疗OA时影响线粒体的功能所涉及机制的研究，于模型组、CHS组分别加入AMPK、SIRT1、PGC-1α的特异性抑制剂Cc、Ex527、SR-18292，观察抑制剂对CHS发挥药理作用的影响，以明确CHS作用的信号通路。通过检测AMPK、SIRT1、PGC-1α、NF-κBp65相关蛋白及其磷酸化蛋白的表达。结果表明，CHS对OA软骨细胞线粒体功能的保护作用及分子机制可能通过AMPK/SIRT1/PGC-1α信号通路来发挥作用。
(5)为了进一步确定CHS治疗的功能，我们测试了细胞外基质(ECM)的合成和代谢相关蛋白在软骨细胞中的表达。模型组、CHS组分别经Cc、Ex527、SR-18292干预后，Westernblot检测软骨细胞正常表型和肥大表型的标志物胶原II(CollagenII)、聚集蛋白聚糖(Aggrecan)、胶原X(CollagenX)、基质金属蛋白酶13(MMP13)。结果显示，与非刺激对照组相比，IL-1β刺激增加了MMP13和CollagenX的表达，而Aggrecan和CollagenII的表达降低。CHS治疗显著降低了软骨细胞中的MMP13和CollagenX，增强了Aggrecan和CollagenII。而Cc、Ex527、SR-18292三种抑制剂的使用阻断了CHS治疗效果。这些结果表明，CHS通过AMPK/SIRT1/PGC-1α信号通路改善IL-1β诱导的软骨细胞ECM的合成和代谢。
结论：
(1)CHS对OA软骨细胞AMPK活性具有保护作用。
(2)CHS通过AMPK/SIRT1/PGC-1α途径减轻软骨细胞线粒体功能障碍，减轻软骨细胞中IL-1β诱导的氧化应激。
(3)CHS通过AMPK/SIRT1/PGC-1α信号通路维持软骨细胞外基质代谢的平衡，抑制软骨细胞肥大表型，进而改善软骨功能。
OA特征是软骨退化，骨硬化，关节中的低度炎症等，最终引起关节的炎症反应和结构损伤，从而诱导软骨破坏。软骨负责维持细胞基质代谢的稳态平衡。然而，损伤会使软骨细胞功能发生障碍。因此，保护软骨细胞质量和改善软骨细胞功能成为治疗OA的有效手段。
软骨发生病变时，线粒体会发生损伤，尽管糖酵解能力增加，但每个细胞的线粒体数量减少，PGC-1α在OA软骨中表达会降低，导致线粒体的功能失常可产生大量活性氧簇(ROS)，这种氧化应激压力与OA等组织变性疾病密切相关，其增加的ROS可通过损伤胶原与蛋白聚糖、活化基质外金属蛋白酶而促进软骨变性，而AMPK的活化对软骨细胞分化至肥大表型的过程亦发挥着抑制作用。另外，AMPK通常被认为是细胞能量稳态的必要调节者，AMPK使PGC-1α磷酸化，进一步触发SIRT1介导PGC-1α乙酰化。在软骨细胞中，AMPK通过激活PGC-1α可抑制氧化应激、多种炎症反应。
竹节参皂苷Ⅳα(ChikusetsusaponinIVα，CHS)具有多种药理特性，虽然CHS是一种良好的天然抗氧化剂和抗炎小分子药物，但在软骨细胞和骨关节炎中尚未得到研究。本研究旨在探讨CHS对软骨细胞线粒体功能障碍、氧化应激和炎症的影响。用IL-1β刺激软骨细胞，模拟骨关节炎的发病机制。CHS可维持炎性因子刺激时受损软骨细胞AMPK的活性，在完成研究CHS在保护OA软骨细胞中的精确作用后，通过促进线粒体生物合成的AMPK/SIRT1/PGC-1α信号途径，改善OA软骨细胞线粒体功能与氧化应激，CHS在抑制OA软骨细胞向肥大表型转化的分子机制也涉及AMPK/SIRT1/PGC-1α途径。因此本研究明确CHS→AMPK/SIRT1/PGC-1α→线粒体能量代谢/肥大表型→软骨细胞功能的治疗OA的新机制，为精确理解骨关节炎靶向治疗提供重要临床应用价值。
方法及结果：
(1)CHS是一种良好的天然抗炎小分子药物，但在软骨细胞和骨关节炎中的应用尚未得到研究。因此，我们首先对软骨细胞进行了IL-1β、CHS的毒性试验。细胞活力测定发现，用100ng/mlIL-1β、50μMCHS处理的软骨细胞没有明显降低细胞活力。因此，我们在接下来的实验中分别使用了100ng/mlIL-1β、50μMCHS处理。分别采用IL-1β作为OA刺激剂制备软骨细胞体外模型，依据CHS剂量梯度对小鼠原代软骨细胞活率的影响，选择CHS最适剂量梯度及作用时间。结果表明CHS增强AMPK/SIRT1/PGC-1α的表达。基于CHS的最适剂量及作用时间，检测AMPKα1/2、β1/2的蛋白表达及AMPKα1/2磷酸化水平，结果证明CHS对OA软骨细胞AMPK活性的保护作用。
(2)由于骨关节炎软骨细胞存在线粒体功能障碍、损伤和合成缺陷，我们检测了CHS处理的软骨细胞的线粒体膜电位。采用IL-1β刺激诱导线粒体功能障碍。与对照组相比，IL-1β刺激(Model组)24h可显著降低线粒体膜动作电位。然而，CHS治疗可显著减轻IL-1β抑制的线粒体功能障碍，表现为线粒体膜电位改善。AMPK抑制剂化合物C(Compound C，Cc)的使用阻断了CHS治疗的缓解作用。这些结果表明，CHS可能通过AMPK/SIRT1/PGC-1α信号通路减轻IL-1β诱导的软骨细胞线粒体功能障碍。
(3)为了研究CHS是否也能减轻氧化应激，我们测定了软骨细胞中活性氧(ROS)的形成。结果表明IL-1β刺激可增加软骨细胞的ROS形成。然而，CHS治疗显著减轻了IL-1β诱导的氧化应激，显著减少了软骨细胞的ROS形成。此外，Cc的使用阻断了CHS治疗效果。这些结果表明，CHS可能通过AMPK/SIRT1/PGC-1α信号通路改善IL-1β诱导的软骨细胞氧化应激。
(4)为了确定CHS在治疗OA时影响线粒体的功能所涉及机制的研究，于模型组、CHS组分别加入AMPK、SIRT1、PGC-1α的特异性抑制剂Cc、Ex527、SR-18292，观察抑制剂对CHS发挥药理作用的影响，以明确CHS作用的信号通路。通过检测AMPK、SIRT1、PGC-1α、NF-κBp65相关蛋白及其磷酸化蛋白的表达。结果表明，CHS对OA软骨细胞线粒体功能的保护作用及分子机制可能通过AMPK/SIRT1/PGC-1α信号通路来发挥作用。
(5)为了进一步确定CHS治疗的功能，我们测试了细胞外基质(ECM)的合成和代谢相关蛋白在软骨细胞中的表达。模型组、CHS组分别经Cc、Ex527、SR-18292干预后，Westernblot检测软骨细胞正常表型和肥大表型的标志物胶原II(CollagenII)、聚集蛋白聚糖(Aggrecan)、胶原X(CollagenX)、基质金属蛋白酶13(MMP13)。结果显示，与非刺激对照组相比，IL-1β刺激增加了MMP13和CollagenX的表达，而Aggrecan和CollagenII的表达降低。CHS治疗显著降低了软骨细胞中的MMP13和CollagenX，增强了Aggrecan和CollagenII。而Cc、Ex527、SR-18292三种抑制剂的使用阻断了CHS治疗效果。这些结果表明，CHS通过AMPK/SIRT1/PGC-1α信号通路改善IL-1β诱导的软骨细胞ECM的合成和代谢。
结论：
(1)CHS对OA软骨细胞AMPK活性具有保护作用。
(2)CHS通过AMPK/SIRT1/PGC-1α途径减轻软骨细胞线粒体功能障碍，减轻软骨细胞中IL-1β诱导的氧化应激。
(3)CHS通过AMPK/SIRT1/PGC-1α信号通路维持软骨细胞外基质代谢的平衡，抑制软骨细胞肥大表型，进而改善软骨功能。