初级纤毛（primary cilium）是一种保守的、具有微管结构的天线样感觉细胞器,存在于大部分脊椎动物细胞表面,其通过接收细胞外的信号,如hedgehog、Wnt等,并将这些信号传递到细胞内,进而参与调控胚胎发育、组织稳态以及肿瘤发生等重要的生物学过程。当细胞进入静息期（G0期）时,初级纤毛以中心体的母中心粒微管为基核,向外延伸组装而成。初级纤毛的形成是一个精确且高度有序的组装过程,包括早期纤毛泡（CV）的形成、TTBK2（Tau tubulin kinase 2）的母中心粒招募、CP110-CEP97复合物从母中心粒上移除、过渡区（TZ）的组装以及微管轴丝的延长等。初级纤毛的缺陷或异常会导致一系列严重的疾病,如BBS综合征、Joubert综合征、MKS综合征、肾消耗症（NPHP）、多囊肾（PKD）以及一些神经退行性疾病等,被统称为纤毛缺陷性疾病（ciliopathies）。当前,纤毛缺陷性疾病的诊断和治疗仍然面临巨大的困难,许多这类疾病的病因还不完全清楚。因此,深入理解初级纤毛发生的分子机制对于纤毛缺陷性疾病的诊断和治疗具有重要的科学价值。中心体蛋白CP110（Centriolar Coiled-Coil Protein 110）是最早被发现的纤毛负调控子,其定位于中心体的两个中心粒远端,形成一个帽子样的结构,抑制微管轴丝的延伸,进而防止增殖细胞中异常的初级纤毛发生。而在初级纤毛发生的早期,CP110从母中心粒上的移除释放了母中心粒的中心体角色并促使中心体向基体转换,促进初级纤毛的形成。因此,通常认为CP110从母中心粒上的移除是初级纤毛发生的必要分子事件。尽管当前已有研究显示,TTBK2、MARK4、MPP9以及Centrin2等蛋白参与调控CP110从母中心粒上的移除。然而,直接调控CP110从母中心粒上移除的分子机制仍然不清楚。线性泛素化链组装复合物LUBAC是目前体内被发现的唯一一个线性泛素E3酶,由HOIP、HOIL-1L以及SHARPIN组成,催化底物蛋白发生泛素分子头尾连接的泛素化修饰方式,称为线性泛素化（linear ubiquitination）。截止目前,LUBAC最主要的功能是在炎症反应中通过线性泛素化NEMO、RIPK1、TNFR1以及RIPK2等蛋白,促进NF-κB信号通路的激活。此外,LUBAC也催化IRF3、ASC以及STAT1等蛋白的泛素化,调控细胞死亡、炎症小体的激活以及抗病毒免疫反应等生物学过程。尽管已有以上的这些发现,但对比K48和K63位支链状泛素化修饰,线性泛素化的功能研究仍然很少。因此,线性泛素化的生物学功能以及其生理意义仍需要进一步发掘。本研究前期发现LUBAC的核心催化亚基HOIP定位于中心体上,提示LUBAC可能参与初级纤毛的发生过程。通过文献调研显示,目前并未发现LUBAC催化的线性泛素化在初级纤毛发生过程中有任何功能的报道。因此,本研究拟通过分子生物学以及细胞生物学相关技术分别在细胞水平和动物水平研究LUBAC在初级纤毛发生过程中的功能,并进一步探讨其调控初级纤毛发生的分子作用机制。首先,通过在He La细胞和RPE-1细胞中过表达GFP融合表达的HOIP蛋白（GFP-HOIP）,再次确认LUBAC的核心催化亚基HOIP定位于中心体。接下来,为了研究LUBAC对初级纤毛发生的影响,利用RNAi干涉技术敲低RPE-1细胞中的LUBAC各组分,血清饥饿48小时后,检测初级纤毛发生的情况,结果显示LUBAC的敲低强烈抑制了初级纤毛的形成。同时,在HOIP敲低的细胞中分别回补野生型HOIP和酶失活突变体C885S,发现野生型HOIP的回补能显著的恢复初级纤毛的发生,但酶失活突变体C885S不能。这些结果表明LUBAC调控初级纤毛的发生且依赖其E3酶活性。已知在初级纤毛发生过程中,母中心粒附属结构、纤毛泡的形成、TTBK2的母中心粒招募、以及CP110-CEP97复合物的母中心粒移除对于初级纤毛的形成至关重要。通过免疫荧光染色对这些过程进行检测,结果发现LUBAC的敲低特异的抑制了CP110-CEP97复合物从母中心粒上移除,且在HOIP缺失的细胞中敲低CP110,明显恢复了初级纤毛的形成,暗示着LUBAC通过促进CP110-CEP97复合物从母中心粒上移除进而调控初级纤毛的发生。进一步,CP110和CEP97的线性泛素化分析显示,LUBAC特异的使CP110发生线性泛素化,体外线性泛素化分析也证实了这一点。更重要的是,在初级纤毛发生过程中,内源的CP110发生了线性泛素化,表明在初级纤毛形成过程中CP110是LUBAC的线性泛素化底物,也提示LUBAC可能通过线性泛素化CP110进而调控初级纤毛的形成。意料之中的是,废除CP110的线性泛素化明显抑制CP110从母中心粒上移除以及初级纤毛的形成,证明LUBAC调控初级纤毛的发生的确是通过线性泛素化CP110来实现的。更进一步,通过质谱技术以及一系列实验,m RNA前体剪切因子PRPF8（Pre-m RNA processing factor 8）被鉴定为CP110的线性泛素化受体,驱动CP110从母中心粒上移除,进而促进初级纤毛的形成。最后,本研究以斑马鱼作为研究模型,利用两条靶向hoip的反义吗啉代核苷酸（antisense morpholino oligonucleotide）在斑马鱼中敲低LUBAC的核心催化亚基hoip,研究了LUBAC在体内的初级纤毛相关功能,结果发现hoip的缺失导致斑马鱼KV泡（Kupffer’s vesicle）的初级纤毛缺陷,并进一步引起斑马鱼的左右不对称缺陷、脊柱弯曲以及心包水肿等发育缺陷表型,证明LUBAC在体内调控初级纤毛相关的生物学过程。综上所述,本研究发现LUBAC通过线性泛素化CP110,调控其从母中心粒上移除,并进一步证明PRPF8作为CP110的线性泛素化受体,驱动CP110从母中心粒上移除,进而促进初级纤毛的发生。本研究不仅报道了LUBAC催化的线性泛素化在初级纤毛组装过程中的关键作用,也揭示了一个CP110从母中心粒上移除的直接调控机制,部分回答了本领域内关于CP110如何从母中心粒上移除的问题。同时,LUBAC的缺失引起初级纤毛缺陷相关的疾病表型,如左右不对称缺陷,体现了LUBAC在胚胎发育过程中的重要生理学功能,也暗示LUBAC调控的初级纤毛发生可能为纤毛缺陷性疾病的病理诊断与临床治疗提供新的思路与策略。