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创新和应用完美的骨移植材料来替代自体骨,治疗和修复各种原因引起的骨缺损,一直是骨科临床医生和材料研究人员共同追求的目标。理想的植骨材料应该具备以下特点:良好的生物相容性、生物可降解性、骨传导性、骨激发性、较高的孔隙率合适的孔径范围、临床使用方便、足够的力学强度及合适的弹性模量。生物活性玻璃(Bioglass)由于其良好的生物相容性、良好的骨传导和骨激发作用而被材料学者所关注,然而目前临床上应用的生物活性玻璃无法提供较强的抗压强度,无法应用于承重部位骨缺损的修复和治疗。因此,改良和提高生物活性玻璃的生物力学性能同时又保持其良好的促进骨激发的能力,成为广大学者研究的热点。本课题组成员与美国诺邦公司生物制品有限公司合作,通过改良生物活性玻璃的成分及制作工艺,制作了新型多孔块体生物活性玻璃(macro-pore bone block,MPBB)。本研究旨在验证MPBB是否在拥有一定的生物力学强度的同时,又具有良好的生物相容性,且能刺激骨组织再生。多孔块体生物活性玻璃对成骨细胞粘附、增殖以及分化影响的体外研究目的探讨多孔块状生物玻璃(MPBB)在体外环境中对成骨细胞粘附、增殖以及分化的影响。方法1.以β-磷酸三钙(β-TCP)为对照,扫描电镜下分析比较MPBB与β-TCP的形态结构、能谱分析两种材料的主要成分;2.将MPBB与β-TCP分别悬浮浸泡于模拟体液中,扫描电镜下观察两种材料的表面反应;3.利用MPBB与β-TCP浸提液培养MC3T3-E1小鼠成骨细胞,光学显微镜下观察细胞大体情况并进行吉姆萨染色进行细胞计数比较;4.将MC3T3-E1小鼠成骨细胞直接种植于MPBB与β-TCP材料上,扫描电镜下观察细胞粘附材料情况,利用MPBB与β-TCP浸提液培养MC3T3-E1小鼠成骨细胞,进行细胞黏着斑蛋白(Venculin)免疫荧光染色比较两种材料对成骨细胞的核质比、Venculin免疫荧光强度;5.利用MPBB与β-TCP浸提液培养MC3T3-E1小鼠成骨细胞,进行Brd U免疫荧光染色及MTT检测比较两组成骨细胞的Brdu阳性细胞比率及OD值;6.利用MPBB与β-TCP浸提液培养MC3T3-E1小鼠成骨细胞,进行成骨细胞特异性转录因子(OSX)免疫荧光染色检测、碱性磷酸酶(ALP)染色、钙结节检测、实时定量PCR检测比较两组成骨细胞的OSX阳性细胞比率、ALP活性率、矿化率及成骨基因m RNA相对表达量。结果1.扫描电镜下观察比较MPBB与β-TCP,发现MPBB表面更加崎岖,更加疏松多孔、不平整,能谱分析发现,MPBB具有β-TCP所没有的Si元素,而β-TCP中Ca、P的含量最多。2.MPBB与β-TCP的模拟体液浸泡实验结果显示,MPBB在浸泡6小时时已有羟基磷灰石沉积,随着浸泡时间延长羟基磷灰石的沉积量逐渐增加,而β-TCP表面始终没有羟基磷灰石形成。3.吉姆萨染色结果显示MPBB组的成骨细胞数量更多,排列规则紧密,在光学显微镜400×镜下计数,MPBB组成骨细胞个数为106.0±6.025,β-TCP组成骨细胞个数为40.20±3.639,两者差异具有统计学意义(P<0.01)。4.将MC3T3-E1小鼠成骨细胞直接种植于MPBB与β-TCP材料上,扫描电镜下发现MPBB组成骨细胞伪足较β-TCP多,粘附状态更好,Venculin免疫荧光染色结果显示MPBB组成骨细胞核质比、Venculin荧光强度较β-TCP组高,两组差异均具有统计学意义(P<0.05)。5.Brd U免疫荧光染色结果显示MPBB组的Brdu阳性细胞比率比β-TCP组高,两组差异具有统计学意义(P<0.05);MTT结果显示第3天时MPBB组成骨细胞OD值较β-TCP组高,两组差异具有统计学意义(P<0.05),第5天时,两组细胞OD值都有增高,但MPBB组OD值明显较β-TCP组高,两者差异具有统计学意义(P<0.01)。6.OSX免疫荧光染色检测中,MPBB组OSX阳性细胞比率较β-TCP组高,两组差异具有统计学意义(P<0.01);ALP染色定量分析发现,MPBB组的成骨细胞ALP活性率较β-TCP组高,两组差异具有统计学意义(P<0.01);钙结节检测结果也表明,MPBB组的成骨细胞矿化率较β-TCP组高,两组差异具有统计学意义(P<0.05);实时定量PCR检测两组成骨细胞的成骨相关基因表达量结果显示,第4天时MPBB组成骨细胞的ALP、OCN(骨钙素)、Collagen 1(1型胶原蛋白)的m RNA相对表达量已超过β-TCP组,且差异都具有统计学意义,到第7天时,MPBB组成骨基因m RNA相对表达量进一步增加。小结MPBB相对于β-TCP含有较多的Si元素,能促进MC3T3-E1细胞的贴附能力,并对其增殖、活力及成骨分化都具有明显的促进作用,具有较好的生物活性。多孔块体生物活性玻璃在兔体内成骨活性、力学性能的初步研究目的探讨多孔块体生物玻璃植入兔体内后的生物活性生物相容性、成骨能力以及生物力学性能。方法制作新西兰大白兔双侧股骨髁缺损模型,分别于股骨髁缺损部植入多孔块体生物玻璃(MPBB)、β-磷酸三钙(β-TCP)、固骼生?(Nove Bone),按植入材料的不同分为三组,即为MPBB组、β-TCP组、Nove Bone组,术后进行X线检查观察材料放置情况及固定是否牢固、髁部有无骨折,并于术后4周、12周、24周取材后,通过Micro-CT检测三组材料的新骨生成体积百分比及剩余材料体积百分比,采用四环素、钙黄绿素荧光双标检测三组材料的新骨生成速率,通过不脱钙硬组织Van Gieson染色检测三组材料的新骨生成面积百分比,通过生物力学检测三组材料的压缩强度、弹性模量。结果术后X线检查显示各组材料填充充分、完全,放置情况良好;Micro-CT结果显示,12周时MPBB组、β-TCP组、Nove Bone组的新骨生成体积百分比分别为(16.83±1.01,9.88±1.23,21.35±1.27),材料剩余体积百分比分别为(50.96±1.37,68.29±3.93,19.37±1.40),24周时,MPBB组、β-TCP组、Nove Bone组的新骨生成百分比分别为(37.48±0.70,25.29±1.45,27.03±1.25),24周时MPBB组与β-TCP组、Nove Bone组比较差异均具有统计学意义(P<0.001),24周时各组材料剩余体积百分比分别为(34.67±3.52,55.66±2.05,7.52±1.15),β-TCP组较MPBB组比较差异均具有统计学意义(P<0.01),而MPBB组较Nove Bone组比较差异也具有统计学意义(P<0.01);荧光双标结果显示,4周时MPBB组、β-TCP组、Nove Bone组的新骨生成速率分别为(1.577±0.045,2.064±0.068,1.19±0.09)um/d,MPBB组较β-TCP组差异有统计学意义(P<0.01);通过Van Gieson染色检测发现,MPBB组、β-TCP组、Nove Bone组在各个时间点新骨生成面积百分比分别为4周时(5.43±1.25,2.77±0.85,6.51±1.21),12周时(8.48±0.84,2.94±0.65,11.42±2.66),24周时(23.55±1.13,12.92±0.45,19.53±0.91),24周时MPBB组新骨生成面积百分比与β-TCP组、Nove Bone组比较差异均具有统计学意义(P<0.001);生物力学检测结果发现,MPBB组与β-TCP组的压缩强度随着时间延长都有一定程度的增加,两者的压缩强度比较没有统计学意义,MPBB组弹性模量术后三个时间点都较稳定,MPBB组和Nove Bone组在弹性模量方面更接近兔骨,β-TCP组的弹性模量植入体内后变化较大。小结MPBB植入兔体内后,表现出了良好的生物活性、生物相容性,同时具有较好的骨激发作用,且植入体内后,具有较强的生物力学性能,为其下一步应用于负重部位骨缺损的植骨提供了实验基础。结论通过以上两部分实验研究表明,MPBB不仅能促进成骨细胞的粘附、增殖,也能从基因水平、蛋白水平促进成骨细胞的分化,具有良好的生物活性、相容性及骨激发性,同时具有一定的力学强度,弹性模量适中,本研究为其应用于临床承重部位骨缺损的植骨提供理论依据。