研究背景毛发具有防御、保护及增加信息交流和美观的作用。毛发由毛囊生成,毛囊是一种结构复杂的皮肤附属器官,持续经历着生长期、退行期和休止期的周期循环性生长。毛囊周期一旦失调,将会影响毛囊正常生长从而导致脱发疾病的发生。随着社会发展,人们对具有保护与美观作用的毛发越来越重视,但临床上疗效确切的促毛发生长药物仍十分匮乏。目前,仅美国FDA批准的口服药物非那雄胺和外用药物米诺地尔具有较肯定的疗效。因此,对促进毛囊再生、毛发生长药物的研究逐渐成为皮肤学领域的研究热点与难点。毛乳头(DP)是毛囊的主要间充质成分,毛乳头细胞是构成毛乳头的主要间质细胞,具有维持诱导上皮细胞增殖分化形成毛囊,促进毛发生长发育和调控毛囊周期循环的能力。鉴于毛乳头细胞具有诱导非毛发皮肤毛囊形成的能力,毛乳头细胞可以作为应于脱发疾病的治疗的靶细胞。毛乳头细胞能分泌多种细胞因子如干细胞生长因子(SCF)、血管内皮细胞生长因子(VEGF)、肝细胞生长因子(HGF)、胰岛素样生长因子(IGF)、转化生长因子β(TGF-β)、骨形成蛋白(BMP)等生长因子和信号转导分子刺激上皮细胞增殖、分化,启动毛囊进入生长期,促进毛囊的生长发育。启动休止期毛囊激活的机制仍不清楚,但是认为来源于毛乳头的信号发挥了至关重要的作用,阻断毛乳头细胞与Wnt信号通路应答的能力将使毛乳头细胞分泌诱导上皮细胞增殖分化的细胞因子的能力下降,导致毛囊周期失调。在调控毛乳头细胞相关的复杂信号通路网络研究中,细胞信号传导(cell signal transduction)日益受到人们重视。经典信号通路Wnt/β-catenin信号对于毛乳头细胞的增殖、细胞因子分泌及诱导毛囊再生至关重要,是调控毛囊发育必须的、最早期和最重要的信号之一。糖原合成激酶3β(GSK-3β)为Wnt/β-catenin经典信号通路的关键分子,GSK-3β激酶失活可激活Wnt/β-catenin信号通路,维持毛乳头细胞诱导上皮细胞增殖、分化及调节细胞周期的能力,从而促进毛囊生长发育。GSK-3β不仅是β-catenin通路激活的关键分子,同时也是PI3K/Akt信号通路重要的下游靶基因,激活PI3K/Akt通路,磷酸化gsk-3β,从而抑制gsk-3β活性可促进细胞增殖,阻碍细胞的凋亡。天冬氨酸-丝氨酸-丝氨酸(dss)是牙本质磷蛋白(dpp)中一个氨基酸重复序列。8dss是一种人工合成的由8个dss重复序列组成的多肽。8dss有很强的结合钙离子的能力,并在牙齿基质的沉积以及矿化过程起到重要作用。研究发现8dss外用于balb/c小鼠脱毛区域后可促进该部位毛发再生(pub.no.us2010/0239503a1)。据此我们推测8dss极可能通过对pi3k/akt/gsk-3β通路的影响从而调控毛囊生长周期进而实现对毛发生长的促进作用。为了验证这一猜想,我们以毛囊生长周期为切入点,围绕wnt/β-catenin和pi3k/akt信号通路,采用real-timepcr,westernblot等方法从细胞及分子水平探讨了8dss对毛乳头细胞诱导功能及wnt/β-catenin和pi3k/akt信号通路的影响及其作用机制,并在脱发小鼠模型上进行了功能验证,以期揭示8dss在毛发生长中的作用及其作用机制。本研究将可能为脱发性疾病提供新的治疗靶点和防治策略。目的1、验证8dss能否促进c57bl/6脱毛小鼠毛发生长及其对毛囊生长周期的影响2、探讨8dss是否具有调控毛乳头细胞增殖、分泌细胞因子、信号分子的作用;3、探讨8dss是否通过调控pi3k/akt/gsk-3β信号通路参与调控毛乳头细胞分泌功能从而促进毛囊的生长发育。材料与方法1、将荧光1%8dss涂抹于处于生长期小鼠背部脱毛区域,观察8dss渗透途径。在小鼠脱毛区域涂抹1%8dss后,于不同时间点观察鼠背皮肤颜色变化及毛发生长情况;取用药7天后小鼠背部皮肤,利用he染色观察镜下毛囊形态变化情况;利用免疫组化检测毛囊中β-catenin表达情况;2、采用“二步酶消化法”提取毛乳头,进行毛乳头细胞培养;利用免疫荧光鉴定毛乳头细胞。3、利用cck8法检测8dss对毛乳头细胞增殖的影响;利用rt-pcr检测8dss对毛乳头细胞分泌细胞因子、信号分子的影响;4、利用westernblot检测p-gsk-3β及p-akt、bcl-2及核内β-catenin表达水平。5、利用特异性抑制剂ly294002阻断pi3k/akt信号通路后,利用westernblot检测p-gsk-3β及p-akt水平的表达。结果1、8dss能够沿毛囊皮脂腺途径渗透荧光8dss局部涂抹脱毛部位皮肤后1小时观察到绿色荧光主要分布在表皮,2小时后8dss逐渐沿毛囊外毛根鞘部位渗透到达整个毛囊,说明8dss能够作用于毛囊部位。2、8dss能够诱导毛囊周期性再生8dss溶液局部涂抹于小鼠脱毛部位后,观察到小鼠背部皮肤颜色粉红色到黑色的转变时间早于阴性对照组,说明8dss能够使毛囊从休止期提前进入生长期,从而促进毛发生长。he染色后显微镜下见8dss处理组毛囊生长期呈iv期表现变,而阴性对照组呈ii期表现。免疫组化显示8dss处理组毛囊显著表达β-catenin。3、8dss能够诱导毛乳头细胞分泌信号分子cck8检测结果显示8dss在不能促进毛乳头细胞增殖,低浓度8dss对毛乳头细胞增殖无明显影响,随着浓度升高对毛乳头细胞反有抑制作用;但是通过rt-pcr分析发现,低浓度8dss处理的毛乳头细胞内wnt信号通路相关基因和转录因子如wnt10b,lef-1和c-myc的表达上调,提示8dss虽不能促进毛乳头细胞增殖,但能促进毛乳头细胞的诱导上皮细胞增殖、分化的能力。4、8dss可诱导核内β-catenin蛋白激活wnt/β-catenin信号8dss处理毛乳头细胞后1h、24h后用westernblot检测结果显示核内β-catenin蛋白表达逐渐增强,并呈时间依赖性,提示8dss可显著增加wnt/β-catenin信号通路在毛乳头细胞内的活性,激活wnt/β-catenin信号通路。5、8dss能激活毛乳头细胞内pi3k/akt信号通路8dss处理后5min、15min、30min、60min用westernblot检测结果显示:抗凋亡因子bcl-2、p-gsk-3β及p-akt表达显著增强并呈时间依赖性,提示8dss可激活毛乳头细胞内pi3k/akt信号通路,并促进其下游靶基因bcl-2的表达抗细胞凋亡,使gsk-3β蛋白磷酸化而失活。6、8dss经由pi3k/akt/gsk-3β信号发挥诱导毛囊周期性再生作用ly294002阻断pi3k/akt信号通路后8dss不能增强gsk-3β及akt磷酸化水平,提示8dss增加wnt/β-catenin信号通路在毛乳头细胞内的活性可能是通过激活pi3k/akt/gsk-3β信号通路实现。结论1、8dss能调控毛囊周期性再生,具有促进毛发生长的作用。这为临床提供新的脱发疾病治疗药物提供了有意义的实验资料。2、8dss能够促进毛乳头细胞分泌wnt相关基因及增强核内β-catenin蛋白表达,PI3K/Akt/GSK-3β信号通路是8DSS调控毛乳头细胞这种功能的关键信号通路,这为8DSS以后用于临床上治疗脱发疾病提供了重要的理论参考。