论文部分内容阅读
大量的研究表明，核苷类似物有抗病毒和抗肿瘤活性。近年来，对于这一方面的研究已逐渐成为热点之一。N-脱氧核糖转移酶催化合成和转化核苷只有一步反应，而之前报道的用核苷磷酸化酶催化核苷的转化则必须有嘌呤核苷磷酸化酶和嘧啶核苷磷酸化酶共同作用才能完成。所以本研究通过构造一个含有N-脱氧核糖转移酶Ⅱ的工程菌，达到转化核苷的目的。
用设计好的引物，将瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)中N-脱氧核糖转移酶Ⅱ的基因PCR扩增出来，然后将其连接到克隆载体pMD18-T上，通过测序鉴定并且BLAST比对正确之后，将N-脱氧核糖转移酶Ⅱ基因从克隆载体上酶切下来，连接到表达载体pET-28a上，转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，构建得到一株连接有N-脱氧核糖转移酶Ⅱ基因的原核工程菌。
对所得到的工程菌进行诱导表达，比较不同温度、诱导时间和IPTG浓度下的蛋白表达量，确定最佳的表达条件。最后在37℃温度诱导4h，IPTG浓度为0.1mmol/L时，工程菌可表达大量的目的蛋白，并且以可溶性胞内表达的蛋白为主。
以诱导后的菌体破碎上清液为酶源，经酶活测定发现，工程菌是野生的瑞士乳杆菌中N-脱氧核糖转移酶Ⅱ活力的22倍。分别研究不同温度、反应时间、pH、底物浓度等条件下脱氧胞苷和脱氧腺苷合成反应的最佳条件，最终得到脱氧胞苷合成的最佳条件是：5mmol/L的底物浓度，在pH为7.1的Tris-HCl缓冲液条件下，加入200μL酶，60℃反应2h，最高转化率为59.19％。脱氧腺苷合成的最佳条件为：5mmol/L的底物浓度，在pH为7.1的Tris-HCl缓冲液条件下，加入200μL酶，60℃反应9h，最高转化率为82.01％。除此之外，研究发现一些过渡金属离子对反应有抑制作用。
研究合成抗肿瘤药物5-氮杂胞苷的条件后，得到最佳的合成条件是：2mmol/L的底物浓度，在pH为7.1的Tris-HCl缓冲液条件下，加入200μL酶，60℃反应2h，最高转化率为61％。