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木质纤维素是自然界中含量丰富的可再生资源,若能将其生物转化成纤维素乙醇和大宗化学品,对缓解目前能源和资源危机具有重要意义,其中,利用纤维素酶将木质纤维素降解成可发酵糖是生物转化的关键。但纤维素酶对木质纤维素低的降解效率和高生产成本是阻碍纤维素乙醇工业化的关键瓶颈。草酸青霉是目前应用比较广泛的生产纤维素酶的微生物,具有稳定性较高、酶系组成较完整等优点,但酶系的降解能力仍有待提高,以进一步减少木质纤维素降解过程中的用酶量,减少纤维素乙醇生产过程的用酶成本。已经证明通过添加辅助蛋白或对纤维素酶分子进行改造,是优化草酸青霉纤维素酶系,提高酶系降解能力的重要途径。本论文基于上述背景,开展了寻找辅助蛋白增强草酸青霉纤维素酶系降解能力及其增强机制、对纤维二糖水解酶Ⅰ（CBHI）进行分子改造提高酶降解底物效率、辅助酶提高草酸青霉纤维素酶系降解DDGS（干酒糟及其可溶物）效果等的研究,希望能进一步提高草酸青霉纤维素酶系对木质纤维素的降解效率,有效降低生物转化用酶成本。本论文的主要研究内容和结果如下:1.里氏木霉与草酸青霉的纤维素酶系中的差异性蛋白对草酸青霉纤维素酶系降解能力的促进作用及机制研究对通过蛋白质组比较发现的在里氏木霉纤维素酶系中含量较高而草酸青霉纤维素酶系中却没有的三个差异性蛋白:纤维素诱导蛋白Cip1、Cip2和木葡聚糖酶Cel74A进行了异源表达,研究了各自对草酸青霉纤维素酶系降解能力的促进作用。研究发现,在草酸青霉纤维素酶系中添加这三个蛋白都可以提高酶系的降解效率,尤其是Cip1,可以明显促进多类预处理后木质纤维素的酶解,且促进效果优于文献报道的一些辅助蛋白如BSA（牛血清白蛋白）。对于木质素含量较高的原料如水热预处理玉米秸秆（LPCS）和木糖渣（CCR）,添加Cip1对酶解的促进效果甚至优于添加等蛋白量的草酸青霉商业纤维素酶。探究了 Cip1促进木质纤维素降解的机理,发现Cip1蛋白并不具有多糖裂解酶活性和各类纤维素酶活性,但Cip1能够破坏原料中纤维素结晶结构,并且减少木质素对酶的非生产性吸附,因此增强了纤维素酶系对底物的降解效率。2.不同来源的碳水化合物结合模块（CBM1）对草酸青霉纤维素酶系降解木质纤维素的增强作用研究真菌纤维素酶通常含有CBM1,其作用被认为是特异性地识别底物。分别异源表达了里氏木霉、草酸青霉和绳状青霉来源的纤维二糖水解酶（CBHI）的CBM1s,添加实验证明这些不同CBM1s都能够增强草酸青霉纤维素酶系对纤维素底物的降解能力,且其增强效果明显优于一些报道的辅助蛋白如BSA。进一步研究发现,CBM1对酶解的增强效果不仅与CBM1的来源有关,还与纤维素底物的特性有关,同时还受酶解时反应条件如蛋白添加量、固形物浓度等的影响。研究了 CBM1与草酸青霉纤维素酶系中的主要酶组分纤维二糖水解酶（CBH）、内切葡聚糖酶（EG）和β-葡萄糖苷酶（BG）等不同蛋白在纤维素和木质素上的吸附动力学,证明CBM1对纤维素和木质素具有更高的亲和力。进一步结合CBM1对水解体系中游离纤维素酶不同酶活性的影响、分子对接预测CBM1与纤维素和木质素模型物分子的结合构象和结合能等,推测CBM1增强纤维素酶系降解底物能力的机制应该是:对底物具有高亲和性的CBM1能够在水解过程中置换出被吸附在木质素上的酶组分,使得更多的纤维素酶被游离释放到水解系统中,从而促进了酶的作用。3.草酸青霉纤维二糖水解酶CBHI的分子改造增强酶降解能力研究在大肠杆菌中分别异源表达了里氏木霉、草酸青霉、绳状青霉、黑曲霉和嗜热毛壳菌等纤维素酶来源的14种CBM1s,通过研究这些CBM1s在纤维素和木质素上的吸附特征,发现与草酸青霉CBHI的CBMPoCBHI相比,来源于绳状青霉的CBMPfCBHI在纤维素上的吸附性强而在木质素上的吸附能力弱,来源于里氏木霉Cip2的CBMTrCip2在纤维素和木质素上都表现出更高的吸附能力,而来源于里氏木霉Swo1（swollenin）的CBMTrSwo1在纤维素和木质素上的吸附能力都较低。利用上述三种CBM1s替换草酸青霉CBHI的相应结构域,对CBHI进行酶分子改造,发现与草酸青霉的CBHI相比,改造后的突变酶CBHIs对可溶性底物pNPC的比酶活大小相近,但突变酶 PRP（PCBHI-CBMPfCBHI）和 PRTC（PCBHI-CBMTrCip2）对滤纸（FP）、氢氧化钠预处理玉米秸秆（NPCS）和LPCS的水解能力要明显优于草酸青霉的CBHI。4.辅助酶增强草酸青霉纤维素酶系对DDGS纤维素降解能力的研究DDGS是干法生产玉米乙醇过程的主要副产品,利用纤维素酶将DDGS中的纤维素降解成可发酵糖进而发酵成乙醇,可达到提高总乙醇产量和改良DDGS品质的目的。分别利用多株草酸青霉工程菌株和里氏木霉产生的纤维素酶系降解DDGS,发现草酸青霉RBB分泌的纤维素酶系降解DDGS时的葡聚糖转化率最高,初步优化了 RBB酶系降解DDGS时的反应条件如酶添加量、固形物浓度、原料颗粒尺寸等,发现当酶添加量高于4mg蛋白/g干底物以后,增加酶用量对葡聚糖转化率的影响不大;适当减少DDGS颗粒尺寸有利于提高葡聚糖转化率,但过度减少反而不利于DDGS的酶解;在实验范围内,固形物浓度对DDGS酶解效率影响不大。在此基础上,开展了利用不同辅助酶增强RBB纤维素酶系降解DDGS效率的研究,分别表达了纤维素酶和半纤维素酶的多种不同单酶组分、以及淀粉酶、果胶酶等酶组分,并将之添加到DDGS的水解体系中,发现不同单酶对DDGS降解效果的促进作用不同,其中添加阿拉伯呋喃糖苷酶、果胶酶和淀粉酶有效地促进了 DDGS的降解,在提高葡聚糖转化率的同时,也提高了水解液中木糖和阿拉伯糖的得率。以DDGS代替发酵培养基中的碳源诱导菌株生产的纤维素酶液中,木聚糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶和果胶酶等酶的活力明显高于采用原始培养基发酵生产的纤维素酶液,对DDGS的降解能力更强,显示了该方法生产纤维素酶的优越性。