牛结核病（bovine tuberculosis）是一种非常重要的人畜共患传染病,主要由牛分枝杆菌（Mycobacterium bovis, M. bovis）感染引起,可以通过吸入含菌的气溶胶或食用未经消毒的牛奶传染给人。牛结核病的防治和彻底根除需要灵敏、有效的诊断方法,目前广泛应用的皮内变态反应试验和IFN-γ释放试验均依赖于PPD作为刺激源,存在检测特异性不高的缺陷。近年来,为了提高检测的特异性,寻找PPD替代刺激源的研究成为了热点,通过比较致病性分枝杆菌和非致病性分枝杆菌基因组,人们发现RD区基因存在差异,因此RD区蛋白有望替代PPD用于区分致病性分枝杆菌与非致病性分枝杆菌感染。TB10.4为牛分枝杆菌RD区蛋白,本研究根据AF2122-97 TB10.4的基因序列分别设计包含起始终止密码子的PCR引物F1/R1和不包含起始终止密码子的PCR引物F2/R2,以牛分枝杆菌ValleeⅢ株基因组DNA为模板,扩增TB10.4基因片段,将其定向克隆到原核表达载体pET-32a（+）和pET-28a（+）中,构建重组质粒pET-32-TB10.4-1（含起始、终止密码子）、pET-32-TB10.4-2（不含起始、终止密码子）和pET-28-TB10.4-3（含起始、终止密码子）,SDS-PAGE结果显示rTB10.4-1、rTB10.4-2以可溶性表达,rTB10.4-3以包涵体形式表达,大小分别为30 ku、30 ku和12 ku,与理论值相符。用AKTA Purifier对可溶性蛋白纯化,用尿素对包涵体蛋白进行洗涤变性复性处理,得到纯度超过90%的rTB10.4-1、rTB10.4-2、rTB10.4-3重组蛋白。分别通过IFN-γ释放试验、荧光定量PCR试验和豚鼠皮试试验三种方法检测TB10.4重组蛋白的T细胞活性。首先根据PPD皮试试验和IFN-γ释放试验(BOVIGAM^TM)筛选出3头牛分枝杆菌感染牛和3头健康牛。1)经颈静脉采集全血,肝素抗凝,分装于48孔细胞培养板中,以等摩尔量rTB10.4-1、rTB10.4-2、rTB10.4-3、载体标签蛋白32a、CFP10:ESAT6重组蛋白（rCE）和牛PPD作为刺激源,37℃培养20 h后用BOVIGAM^TM牛结核分枝杆菌IFN-γ检测试剂盒在蛋白水平检测IFN-γ的表达水平。2)无菌采集肝素抗凝血,分离牛外周血淋巴细胞（PBMC）,用等摩尔量rTB10.4-1、rTB10.4-2、rTB10.4-3、32a、rCE和牛PPD刺激6 h,TRIZOL法提取PBMC总RNA,以β-actin基因为内参,PBS刺激样品为对照,荧光定量PCR检测IFN-γmRNA转录水平。3)用灭活的牛分枝杆菌致敏豚鼠,致敏后40天分别以rTB10.4-1、rTB10.4-2、rTB10.4-3、rCE、32a及牛PPD进行单个重组蛋白的皮试试验,及以rTB10.4-1:rCE、rTB10.4-2:rCE、rTB10.4-3:rCE进行重组蛋白与rCE等质量比混合后的皮试试验,在刺激24 h、48 h和72 h分别测量各检测点的皮肤肿胀部位直径。试验结果表明:重组蛋白rTB10.4能刺激IFN-γmRNA的转录和表达,因此在IFN-γ释放试验中有作为rCE补充候选抗原的能力;在皮内变态反应试验中,TB10.4重组蛋白单独使用时无明显反应,与rCE混合应用时,在24 h时可见与PPD-B刺激后类似的红肿变态反应,表明在皮内变态反应时,可能需要几种或多种蛋白的协同作用。通过Western blot试验表明三种TB10.4重组蛋白均具有一定的反应原性。间接ELISA实验对三种TB10.4重组蛋白的B细胞活性进行检测,结果显示rTB10.4-1、rTB10.4-2、rTB10.4-3三种重组蛋白均具有反应原性,其中rTB10.4-1的反应原性最好。综上所述,本研究表达的TB10.4重组蛋白具有较好的T细胞活性和B细胞活性,具有活性的TB10.4重组蛋白的成功表达纯化为后续建立特异性好、敏感性高、可重复性好的牛结核病的诊断试剂盒奠定了基础。