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研究目的：
血友病B(hemophilia B，HB)是凝血因子Ⅸ(factorⅨ，FⅨ)基因缺陷引起血浆FⅨ含量或活性下降所导致的一种连锁隐性遗传性出血疾病，男性中发病率约为1/30000，严重危害人民健康。FⅨ基因缺陷具有明显异质性，其中无义突变是导致重型HB的重要原因之一。本研究旨在构建4种包含不同类型无义突变的FⅨ真核表达载体，为进一步研究无义突变引起FⅨ表达量降低的机制及其治疗奠定基础。
方法：
1.对血友病B突变数据库进行分析，寻找FⅨ基因无义突变频发位点。
2.采用以PCR为基础的定点突变法体外构建FⅨ基因无义突变真核表达载体，并通过DNA序列分析进一步鉴定证实。
3.应用脂质体转化技术将野生型、突变型FⅨ表达载体分别瞬时转染COS-7细胞，同时进行绿色荧光蛋白(green fluorescent protein，GFP)共转染，使用荧光显微镜观察转染效率。
4.采用实时定量PCR检测不同位点无义突变对FⅨ基因mRNA表达水平的影响并进行统计学分析；采用Western blot方法检测野生型及各突变型FⅨ基因蛋白的表达。
结果：
1.R29X、R116X、W194X、R333X4种FⅨ基因无义突变的病例数集中，发生频率较高。
2.DNA序列分析证明，构建的4个突变型质粒除相应位点无义突变外，未见其它突变，提示无义突变载体构建成功。
3.GFP共转染证实质粒易于转染COS-7细胞并能在其中表达。
4.野生型及各突变组真核表达载体可转染COS-7细胞株并能进行表达。各突变组FⅨ基因mRNA表达水平与野生型相比无统计学差别(P＞0.05)。
结论：
1.成功构建4种发生频率高的FⅨ无义突变真核表达载体，并验证了该表达载体可在COS-7细胞中进行表达。
2.表达载体中的无义突变对FⅨ基因mRNA表达水平无影响，可能与实验采用的FⅨ基因为无内含子的cDNA有关。