许多患有肿瘤、血液疾病或自身免疫性疾病的女性患者因为医学水平的提高而获得到治愈，但其卵巢功能由于物理或化学治疗而遭到了严重损害或衰竭。因此，卵巢功能的保护受到越来越多的重视，目前保存女性生殖能力的方法有以下几种：使用一些相应的药物来保护卵巢、冷冻保存胚胎、冷冻保存卵子、卵巢组织的冷冻保存与移植等。卵巢组织的冷冻保存是一种有潜力的方法，因为其中含有大量的受冷冻影响小的始基卵泡。但是，近来很多研究表明卵巢组织的移植会引起肿瘤的复发，特别是血液系统引起的恶性肿瘤。而从卵巢组织分离得到的卵泡的冷冻保存与移植似乎是一种很好的避免恶性肿瘤传播的方法。Oktay等首次报道了使用胶原酶从人卵巢组织中成功地分离得到了始基卵泡。这种方法可以得到质量好的卵泡，这是分离卵泡培养和移植的必要条件。　　 目前的冷冻方法主要包括慢速冷冻和玻璃化冷冻等。慢速冷冻因为不能避免冰晶的形成，所以限制了其应用。而玻璃化冷冻是一种快速冷冻方法。其降温、复温速度都很快，在极短时间内无法形成冰晶，而是直接地形成“玻璃样”的固态，始终保持了细胞内外的水分子和离子的分布，在某种程度上可以避免细胞内外冰晶的形成，使溶质损伤减轻。固相表面玻璃化冷冻法是近来出现的一种新的玻璃化冷冻方法。该方法是把需要冷冻的细胞和组织放置在较高浓度的冷冻保护剂中平衡一段时间，然后直接放置于预冷至-150℃到-180℃的固相表面，以达到快速降温。卵巢组织移植可以作为保存卵巢功能的一种方法，但是不可避免地会造成肿瘤复发。为了避免肿瘤复发，移植分离卵泡可能是一种好的选择。本研究分为两个部分：　　 第一部分：不同的冷冻方案对分离的大鼠卵泡冷冻保存的研究。　　 目的：探索固相表面玻璃化冷冻方法与以往的慢速冷冻方法、开放式拉长麦管玻璃化冷冻方法相比，哪一种方法更适合于分离卵泡的冷冻保存。　　 方法：⑴卵巢组织取自清洁级雌性Spragne-Dawley(SD)大鼠，鼠龄3周。⑵使用浓度为0.04 mg/mL Liberase Blendzyme3分离卵泡。⑶将卵泡放入不同的冷冻液中浸泡后，吸入麦管中，再把麦管放入程序性冷冻仪上，缓慢降温，最后放入液氮中保存。复温时，将卵泡依次放入不同的解冻液中，置换出冷冻保护剂。⑷将卵泡放入不同的冷冻液中浸泡后，吸入开放式麦管中，然后直接把麦管放入液氮中冷冻保存。复温时，将卵泡依次放入不同的解冻液中，置换出冷冻保护剂。⑸将卵泡放入不同的冷冻液中浸泡后，直接将含有卵泡的液体滴在用液氮预冷后的固相表面，使之成为小球，然后把小球移入冷冻管中，放入液氮中保存。复温时，将卵泡依次放入不同的解冻液中，置换出冷冻保护剂。⑹将卵泡放入浓度为2μM Calcein AM和5μM Ethidium homodierⅠ微滴中，然后置于37℃的培养箱中30 min，用DPBS洗涤之后在荧光显微镜下观察。⑺从分离的新鲜卵泡和冻融后的卵泡中随机选择卵泡，经实验处理后行电镜检查。⑻把卵泡移入含有1.5％藻酸钠溶液中，用移液器吸出10μL的液体，然后滴入0.25 M的CaCl2中，立即形成一个微球，把得到的微球移入5孔培养皿中，在培养箱中培养72小时。分析卵泡直径的变化并测量培养液中的雌激素水平。　　 结果：①本实验中对876个卵泡进行了活性分析，在SSV组，完全有活性卵泡的比例为64.76％，高于OPS组(62.38％)，但是差异无统计学意义；而SSV组中完全有活性卵泡的比例显著高于慢速冷冻组(52.65％)，其差异有统计学意义(P＜0.05)。②本实验中对于65个新鲜卵泡和冻融卵泡进行了电镜下超微结构的分析。12个新鲜卵泡中仅有1个卵泡的线粒体出现肿胀。而经过不同冷冻方法冻融后的卵泡则出现了不同的损伤。在各种损伤中粗面内质网的损伤(SSV组、OPS组和慢速冷冻组中的比例分别是：60.0％，50.0％和75.0％)和线粒体的损伤(SSV组、OPS组和慢速冷冻组中的比例分别是：40.0％，50.0％和50.0％)最常见。SSV组中，微绒毛损伤、线粒体损伤和核膜损伤的比例与OPS组的和慢速冷冻组的相比有减少的趋势，其差异无统计学意义。③本实验中共对200个卵泡进行了体外三维培养。新鲜卵泡的体外培养发育能力是最好的，直径增长平均为36.60±2.98μm。而慢速冷冻组的卵泡体外培养发育能力最差，直径增长平均为20.10±2.18μm。SSV组的卵泡直径增长为28.90±2.21μm，显著高于慢速冷冻组的，其差异有统计学意义，P＜0.05。SSV组的雌激素水平明显高于OPS组的和慢速冷冻组的，其差异有统计学意义，P＜0.05。　　 结论：固相表面玻璃化冷冻法(SSV)与以往传统的慢速冷冻法、拉长式开放麦管玻璃化冷冻法相比，是一种更方便、更有效、适合冷冻保存分离后的大鼠卵泡的方法。　　 第二部分：分离的大鼠卵泡异种移植到NOD-SCID小鼠的研究。　　 目的：对冻融后的分离卵泡以藻酸钠为载体建立异种移植的动物模型，观察卵泡的生长发育情况和血管生成情况，并与传统的卵巢皮质片移植作比较，希望找到更适合卵泡生长的移植模式。　　 方法：⑴卵巢组织取自清洁级雌性Spragne-Dawley(SD)大鼠，鼠龄3周。移植用小鼠为NOD-SCID小鼠。⑵使用浓度为0.04 mg/mL Liberase Blendzyme3分离卵泡。⑶将卵泡或者卵巢皮质片以不同的冷冻保护剂溶液浸泡后，直接将含有卵泡或者皮质片的液体滴在用液氮预冷过的固相表面，使之成为小球，然后把小球移入冷冻管中，放入液氮中保存。复温时，将卵泡或者皮质片依次放入不同的解冻液中，置换出冷冻保护剂。⑷以藻酸钠为载体，把分离的卵泡移植到小鼠一侧的肾脂肪囊下。另一侧肾脂肪囊下移植取自同一只大鼠的卵巢皮质片。⑸回收的移植物经HE染色后，在光镜下分析计数卵泡。⑹用CD31分析移植物微血管生成情况，用Ki-67分析卵泡的增殖性。　　 结果：①移植后第3、5、7、14、28天回收到的移植物中卵泡数量分别为：5、5、51、1、3个。按移植的时间分析，移植效率分别为：3.68％、2.91％、25.24％、0.69％、2.10％。②移植后第3、5、7、14、28天回收到的移植物中卵泡数量分别为：1760、1575、1860、1830、640。移植后各个时间点的皮质片移植回收卵泡数目均大于相同时间点的微球移植回收到的数目，其差异有统计学意义(P＜0.05)。③通过统计学分析发现：移植后各个时间点的皮质片移植物中的微血管密度均大于相同时间点微球移植的，其差异有统计学意义(P＜0.05)。　　 结论：分离的卵泡移植以后有部分可以继续存活，但是因为其较低的回收率，不能完全替代皮质片移植，只要在肿瘤复发风险高的情况下才可以谨慎选择尝试此种方法。