研究目的和依据左旋多巴(L-DOPA)是临床治疗帕金森病(Parkinson’s disease, PD)的常用药物。L-DOPA诱发的异动症(levodopa-induced dyskinesia, LID)是L-DOPA长期治疗过程中普遍出现的并发症。由于LID的发病率高、病程长,严重影响了PD患者的治疗和生活质量。因此,对本病进行深入研究、采取积极的预防和治疗措施具有重要的社会意义和深远的科学意义。PD的严重程度是LID的发病基础；由于L-DOPA半衰期较短,因此反复给予外源性L-DOPA引起血药浓度的波动性刺激是引起LID发生的主要诱因；基底节-丘脑-皮质环路是发病机制中主要的信号传导通路；LID与纹状体多巴胺(DA)受体介导的直接通路(兴奋性)和间接通路(抑制性)活动失衡有关。在此环路中,DA、5-羟色胺(5-HT),兴奋性氨基酸谷氨酸(Glu)及抑制性氨基酸γ-氨基丁酸(GABA)等均为主要的神经递质,调节环路的活化及抑制。同时兴奋性氨基酸升高引起的兴奋性毒性也可对神经元进行损伤,为神经退行性疾病的常见发病机制之一。PD阶段脑内氧化／抗氧化系统已经出现失衡,L-DOPA及DA代谢过程中,产生大量的羟自由基,活性氧(ROS)等物质,使本已失衡的DA能环路功能更加异常。机体更易受到氧化应激的损伤。因此,LID的发生发展是受到多种致病因素共同作用的结果。中药首乌方(SWF)是根据古方记载、参考现代研究、结合课题组人员的临床经验优选出的中药复方,由首乌、鹿茸、天麻、钩藤、厚朴等中药组成,是针对LID中医病机—肝肾阴虚,气血不足而组成的方药。临床证明与美多芭协同治疗PD可提高美多芭疗效,减轻副作用。本实验室对SWF的前期研究表明,SWF对PD大鼠具有降低脑内及血中L-DOPA、DA波动性的作用,提示了SWF干预LID的可能性。因此本课题拟采用PD基础上的LID大鼠模型,观察SWF预防性给药对大鼠LID的发病率及行为学指标的影响,并应用微透析-高效液相(HPLC)技术,通过观察活体大鼠病变靶器官(脑纹状体)内多种递质及神经化学物质水平的变化,探索SWF干预LID的机制。体外实验部分,通过建立6-羟基多巴胺(6-OHDA)损伤的SH-SY5Y细胞模型,观察SWF中有效成分二苯乙烯苷(TSG)、川芎嗪(Lig)、鹿茸蛋白混合物(VAPs)对该细胞模型存活率的影响,并从细胞内钙超载,细胞外兴奋性毒性及氧化应激等方面进行机制探讨,为SWF干预LID的作用提供药理学依据。研究方法(1)脑内单侧双位点注射6-OHDA制作PD大鼠模型。在PD大鼠模型基础上反复给予美多芭诱发LID,并同时投药SWF(高,中,低剂量组)共22天。每7天进行一次异常不自主运动(AIM)评分,共评价4次(21天)。微透析当天灌胃最后一次药物。分别就前肢,口面部不自主运动、轴性肌张力障碍及旋转运动进行评定,每个部分根据其严重程度划分为五个等级(0～4分)。从给药后30 min开始评价,每30 min一次,评价4次共120 min,记录4个时间点AIM评分的总和。通过LID和严重LID发病率(AIM评分>20),以及AIM评分评价SWF对于LID大鼠行为学的影响。(2)应用脑微透析方法对各组大鼠清醒自由活动状态下进行脑内纹状体细胞外液采样：流速2 μL/min,每30 min收集1管,至给药后240 min。高效液相-荧光法(HPLC-FLD)检测微透析样品中兴奋性和抑制性氨基酸类神经递质(Glu,GABA等)的浓度；高效液相-电化学(HPLC-ED)法检测微透析样品中DA代谢产物的变化；采用水杨酸灌流捕获活体脑内不稳定的羟自由基,使其形成稳定的物质2,3-二羟基苯甲酸(2,3-DHBA)和2,5-二羟基苯甲酸(2,5-DHBA),应用HPLC-ED检测其浓度变化。(3)采用黄嘌呤氧化酶法和硫代巴比妥酸比色法测定LID大鼠血清中超氧化物歧化酶(SOD)活力及丙二醛(MDA)浓度,应用酶联免疫吸附方法(Elisa)检测LID大鼠血清中炎性因子白细胞介素1β(IL-1β)、白细胞介素6(IL-6)和肿瘤坏死因子(TNF-a)的浓度。(4)应用MTT方法分析TSG、Lig及VAPs对6-OHDA损伤的SH-SY5Y细胞存活率的影响。激光共聚焦显微镜检测细胞内钙离子浓度的变化及核因子-E2相关因子-2(Nrf2)在细胞内的分布。HPLC-FLD方法检测细胞上清液中Glu及GABA浓度的变化。Elisa方法检测细胞内血红素氧合酶(HO-1)的变化。研究结果(1)LID大鼠出现异常不自主运动,如颈部扭转,上肢抖动,对侧旋转等。严重LID发病率增加,AIM评分升高,SWF可降低严重LID的发病率及AIM评分。与LID组相比,SWF高剂量组(SWF-H组)在D14和D21显著降低AIM评分(P<0.05)。(2)SWF对LID大鼠纹状体细胞外液兴奋性氨基酸Glu和天门冬氨酸(Asp),抑制性氨基酸甘氨酸(Gly)及GABA的升高有抑制作用。与LID组相比,SWF低剂量组(SWF-L组)、SWF中剂量组(SWF-M组)和SWF-H组各有1个、1个和3个时间点显著降低了Asp的浓度(P<0.05或P<0.01)； SWF-L组和SWF-H组分别有1个时间点降低了GABA浓度(P<0.05或P<0.01)。(3)SWF可以抑制LID大鼠纹状体细胞外液羟自由基指标2,3-DHBA及2,5-DHBA的增高。与LID组相比,SWF-M组有1个时间点降低了2,3-DHBA浓度的升高(P<0.05),SWF-L组和SWF-M组各有1个时间点降低了2,5-DHBA浓度的升高(P<0.05或P<0.01)。LID大鼠血清中SOD活力及MDA浓度均升高,SWF虽然对SOD活力影响不明显,但可以显著降低血清中MDA水平(P<0.01)。(4)LID大鼠纹状体细胞外液DA代谢产物3,4-二羟基苯乙酸(DOPAC)和高香草酸(HVA)呈先高后低的波动性变化。SWF可以改善这种波动性变化；SWF对5-HT的代谢产物5-羟吲哚乙酸(5-HIAA)的升高有抑制作用。与LID组相比,SWF-M组有1个时间点的降低有统计学意义(P<0.05)。(5)LID大鼠血清中IL-1β浓度升高,IL-6和TNF-a变化不明显。SWF对LID大鼠血清中IL-1β的升高有一定的降低作用；对IL-6和TNF-a无明显影响。(6) TSG, Lig及VAPs在一定浓度范围内可以提高6-OHDA损伤的SH-SY5Y细胞存活率(P<0.05或P<0.01)。TSG和Lig可抑制细胞内钙离子浓度增高(P<0.05),并降低细胞上清液中Glu及GABA浓度的升高(P<0.05或P<0.01)。(7)Lig及VAPs对6-OHDA损伤后引起的Nrf2的核迁移有促进作用；并可以增加6-OHDA损伤的细胞内HO-1的浓度(P<0.05)。结论(1)PD大鼠在反复给予美多芭后可出现异动症的表现,SWF对LID发病率没有明显影响,但可以减轻严重LID(AIM评分>20)发病率,改善大鼠的异常不自主运动症状。(2)LID大鼠脑内纹状体细胞外液中氨基酸类神经递质失衡,同时兴奋性氨基酸升高对神经细胞有兴奋性毒性作用。SWF可以调节氨基酸类神经递质失衡,减轻兴奋性毒性引起的细胞损伤。(3)LID大鼠纹状体细胞外液羟自由基指标的浓度升高,血清中MDA水平增高。SWF降低了纹状体细胞外液羟自由基指标和血清中MDA水平的升高,可能对LID大鼠,尤其是病变靶组织起到抗氧化的保护作用。(4)LID大鼠脑内纹状体细胞外液中DA代谢产物随时间产生波动性变化,SWF可以缓解这种波动性变化,可能通过减轻DA受体受到的波动性刺激,从而起到预防和缓解LID症状的作用。(5)LID大鼠体内炎性因子没有明显的变化,SWF对炎性因子也没有表现出明显的调节作用。(6)体外实验表明,SWF中三种有效成分TSG, Lig及VAPs在一定浓度内提高6-OHDA损伤后的细胞存活率,其可能通过减轻钙超载,抑制兴奋性毒性及抗氧化对外源性神经毒性损伤具有保护作用。