【摘 要】
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副猪革拉瑟氏菌（Glaesserella parasuis,GPS）属于巴氏杆菌科,是一种寄生于猪上呼吸道的胞外共生细菌,也是健康猪正常微生物群的一部分。在猪机体免疫力下降或者应激条件下,GPS可引起猪的革拉瑟氏（Gl（?）sser）病,其特征是纤维素性肺炎、关节炎及脑膜炎。由GPS侵染而引起仔猪的革拉瑟氏病会对养猪业带来巨大损失,同时因为GPS的致病性尚不完全明确,对它的有效防治与管理依然是一个
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副猪革拉瑟氏菌（Glaesserella parasuis,GPS）属于巴氏杆菌科,是一种寄生于猪上呼吸道的胞外共生细菌,也是健康猪正常微生物群的一部分。在猪机体免疫力下降或者应激条件下,GPS可引起猪的革拉瑟氏（Gl（?）sser）病,其特征是纤维素性肺炎、关节炎及脑膜炎。由GPS侵染而引起仔猪的革拉瑟氏病会对养猪业带来巨大损失,同时因为GPS的致病性尚不完全明确,对它的有效防治与管理依然是一个挑战。在细菌感染的过程中,致病菌与宿主细胞间的相互作用会引起两种生物体内基因的表达发生巨大改变,为了便于能够更好的了解其相互作用的机制,本研究采用体外细胞模型,使用GPS感染新生猪气管上皮（Newborn pig tracheal,NPTr）细胞,利用互作转录组测序技术（Dual RNA-seq）同时检测GPS和NPTr细胞的差异表达mRNA谱,进而有利于揭示GPS与NPTr细胞的相互作用机制;同时选取了GPS在感染NPTr细胞后升高的膜蛋白基因VtaA2进行探究,研究了VtaA2蛋白对GPS在致病过程中的影响。具体结果如下:1.副猪革拉瑟氏菌感染NPTr细胞的互作转录组分析:本研究在体外使用GPS感染NPTr细胞,设立TSB/V/S内培养菌体及无血清DMEM培养NPTr细胞为对照组,将各组进行转录组测序,构建了4个cDNA转录组文库:感染NPTr细胞中GPS的cDNA文库、TSB/V/S内培养菌体的cDNA文库、被感染NPTr细胞的cDNA文库及未感染的NPTr细胞cDNA文库。筛选出了726个GPS差异表达基因,其中383个基因上调,343个基因下调;3420个NPTr细胞差异表达基因,其中2295个基因上调,1125个基因下调（≥4倍,P≤0.05）。通过对感染后GPS差异表达基因进行分析结果显示在感染过程中,磷酸酯代谢（phn D,E,C）、精氨酸代谢（Art M,I,Q,P）、钼酸盐代谢（Mod A,B,C）、铁离子转运（Afu A,B,C、Sit A,B,C,D、Fhu D,B,C）、血红素吸收（Ccm A,B,C,D）、脂蛋白代谢（Lol C,E,D）及精胺/腐胺的代谢（Pot A,B,C,D）等营养摄取相关基因都上调表达,毒力因子如Cap D、Gal U、CDT等上调表达,但之前报道的多数毒力因子发生了下调。对感染后的NPTr细胞的差异表达基因分析发现Toll-like receptor signaling pathway、Focal adhesion、Oxidative phosphorylation、PI3K-Akt signaling pathway、Adherens junction、TNF signaling pathway及ECM-receptor interaction等都发生了显著变化,尤其是在免疫信号与细胞外基质相关通路方面,例如Cxcl 8、Cxcl 10、CCL5、IL-6、胶原蛋白、层连蛋白及整合素基因等都发生了上调,提示在感染过程中这些基因在抗GPS感染发挥着重要的作用。2.副猪革拉瑟氏菌VtaA2蛋白功能研究:本研究中使用同源重组的方法构建出VtaA2基因的缺失变异株,再使用质粒克隆VtaA2基因电转入缺失突变株得到互补株。通过PCR与qPCR的试验证明了VtaA2基因成功缺失。生长曲线表明VtaA2基因在缺失与互补之后不会对菌株的生长产生影响;使用健康猪血清检测三株菌对血清中补体的抗性发现缺失株对90%猪血清的抵抗能力显著高于野生株与互补株,证明VtaA2蛋白可能参与了补体杀伤GPS的过程;通过生物被膜与自身凝集试验分析得出VtaA2蛋白可以影响GPS的自凝集过程并进一步影响了GPS生物被膜的形成;在抗吞噬能力方面发现在VtaA2基因缺失后不影响PAM细胞对其的吞噬。通过小鼠毒力试验与小鼠载菌量试验证明了缺失株对小鼠的致死率要低于野生株与互补株,并且缺失株在小鼠肝和肺脏中的菌量显著低于野生株和互补株。最后使用黏附侵入试验和激光共聚焦证明了VtaA2蛋白参与了GPS对NPTr细胞的黏附。综合以上结果,本研究通过互作转录组学分析GPS与NPTr细胞的相互作用,发现了在GPS致病和NPTr细胞抗病中发挥了重要作用的基因以及相关通路,鉴定到了GPS中VtaA2蛋白可以调控GPS的致病能力,为后续深入了解GPS的致病机制提供了新的思路。
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