阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)是一种以老年人记忆力减退和认知功能障碍为主要临床特征的中枢神经系统退行性疾病。老年斑(senile plaque, SP)、神经元纤维缠结(neurofibrillary tangles, NFT)和神经突触减少或神经元丢失是AD的主要病理特征,病变主要累及海马和皮层。其中,老年斑的主要成分是β-淀粉样多肽(beta-amyloid peptide, Aβ)聚集形成的纤维,而Ap纤维被认为是导致神经元损伤及认知功能障碍的主要致病物质。因此,阻止Aβ多肽聚集及清除大脑病变区已形成的Aβ多肽可能成为AD治疗的突破口。多项动物实验表明,通过外周给予抗Ap抗体能有效降低脑内Ap沉积的水平并减轻认知功能的损害。但是血脑屏障的阻碍使得外周抗体很难穿过血管进入大脑,因而限制了抗体清除Ap淀粉样斑块的效率,使其应用潜力受到限制。而鼻脑之间直接通路的存在使得通过鼻腔向脑内递送抗体类的大分子物质成为可能。近年来研究发现,霍乱毒素B亚单位(Cholera Toxin B subunit, CB)能与神经细胞膜表面的神经节苷脂(GM1)配体特异结合,经嗅神经细胞轴浆转运至大脑内。本研究将Ap多肽抗体与CB偶联,利用CB与GM1受体配体结合主动转运的特性,将抗体带入脑内。CB与Aβ抗体偶联及其入脑后是否能发挥有效的生物学作用,尚未见报道。本课题组前期研究中已证明了霍乱毒素B亚单位与Ap多肽抗体形成的偶联物(CB-IgG)通过鼻腔给药后能绕过血脑屏障高效进入正常小鼠脑内。但偶联物CB-IgG是否能高效进入痴呆小鼠脑内发挥生物学效应尚不清楚。在前期研究的基础上,本研究将Aβ多肽抗体(IgG)与CB偶联,滴鼻后观察是否能够有效的进入转基因模型小鼠脑内,发挥抗体的生物学效应,抑制小鼠脑内Aβ沉积和淀粉样斑块的形成。本课题的研究内容主要包括三个部分：CB-Aβ多肽抗体经鼻入脑效率的研究,转基因痴呆小鼠的基因型和病理学特点鉴定,CB-Aβ多肽抗体抑制Aβ斑块形成的动物体内试验。第一部分目的：CB-Aβ多肽抗体偶联物经鼻入脑的效率研究。方法：分别采用改良过碘酸钠法及戊二醛两步法制备CB与Aβ多肽抗体的偶联物CB-IgG,选择最佳的偶联方法用于后续实验。32只C57小鼠鼻腔给予CB-IgG后,用间接ELISA法测定不同时间点小鼠脑内抗体量。16只C57小鼠分为CB-IgG IN组、IgG IN组、IgG IV组和正常对照组,抗体给予3h后用间接ELISA法测血清和脑区抗体量。结果：选择用过碘酸钠法制备偶联物CB-IgG,经鼻腔给予C57小鼠后,0.3h即可在脑内检测到Aβ抗体的存在(P<0.05),3h后达峰值(P<0.001)。CB-IgG IN组海马区的抗体量高于IgG IN组和IgG IV组10倍以上(P<0.05),在皮层和嗅球分别比后两组高8.96倍和6.92倍(P<0.05),IgG IV组与IgG IN组脑内的抗体量很接近,是正常对照组的3-4倍(P<0.05)。各组小脑内的抗体量均无统计学差异(P>0.05)。各组血清抗体量的A值比较,IgG IV组的抗体量高于其他各组(P<0.05),CB-IgG IN组和IgG IN组与正常对照组相比,无统计学差异(P>0.05)。第二部分目的：从美国JAX实验室引进的两个转基因AD模型鼠(5XFAD小鼠和J20小鼠)基因型和病理学特点的鉴定。方法：转基因模型鼠的批量繁殖,用饱和酚氯仿法提取鼠尾基因组DNA, PCR法鉴定子鼠基因型,分选出转基因阳性和转基因阴性小鼠。免疫组织化学染色观察不同年龄阶段转基因阳性小鼠脑内Aβ沉积和淀粉样斑块的形成情况。结果：最终繁殖得到137只5XFAD小鼠和540只J20小鼠,转基因阳性子鼠所占比例分别为56.93%和41.30%。两者比较,5XFAD小鼠比J20小鼠繁殖能力强,存活率高。文献报道,5XFAD小鼠1.5月龄时开始出现神经细胞内Aβ42的聚集,2月龄时出现淀粉样沉积,J20小鼠5-7月龄时有弥散的淀粉样沉积分布,10月龄时所有小鼠脑内均出现淀粉样斑块。与此相比,本研究观察到,5XFAD小鼠5周龄时即可出现细胞内Aβ42的聚集,9周龄时在海马的下托和皮层可见Ap斑块,J20小鼠5月龄时在海马的齿状回可见少量的Ap斑块,6月龄时在海马和皮层均可见Aβ斑块。第三部分目的：CB-Ap抗体抑制转基因模型鼠脑内Aβ斑块形成的研究。方法：分别选用5XFAD小鼠和J20小鼠进行试验。5XFAD小鼠脑内Aβ斑块的体内抑制试验选用20只7-8周龄的小鼠,分为CB-IgG IN组、IgG IN组、IgG IV组、阳性对照组与阴性对照组。抗体干预组小鼠经不同方式每周给予两次抗体,14周后进行相关检测。Morris水迷宫检测小鼠的空间学习记忆能力,双抗夹心ELISA检测小鼠脑组织匀浆液中的Ap水平,用相关的ELISA试剂盒定量检测脑组织匀浆中Thl型细胞因子γ-IFN和IL-2及Th2型细胞因子IL-4和IL-10的含量,免疫组化染色观察小鼠脑切片的Aβ沉积和老年斑并对阳性斑块面积定量分析。结果：行为学检测结果显示,CB-IgG IN组小鼠找到水下隐性平台的时间与阳性对照组比显著缩短,接近于阴性对照组的水平(P<0.05)。而IgG IN组和IgG IV组的结果相似,即找到水下隐性平台的时间与阳性对照组比也有缩短但不显著,仅两个时间点有统计学差异(P<0.05)。小鼠脑组织匀浆中的Ap含量,CB-IgG IN组、IgG IN组和IgG IV组与阳性对照组比均有不同程度的减少(P<0.05),以CB-IgG IN组的减少最为明显。细胞因子含量的检测结果显示,Th1型细胞因子IFN-y和IL-2的含量各组相比无统计学差异(P>0.05),Th2型细胞因子IL-4和IL-10的含量在CB-IgG IN组、IgG IV组、IgG IN组、阴性对照组阳性对照组之间比较无差异(P>0.05),但显示了依次递减的趋势。脑切片的免疫染色结果观察发现,Ap淀粉样斑块在形态学方面各组之间存在明显差别,阳性对照组以弥漫性非神经突斑、弥漫性神经突斑和有核心的神经突斑为主,而CB-IgG IN组主要是有核心的非神经突斑,且与阳性对照组相比尚存较多的神经细胞。阳性斑块面积比较,CB-IgG IN组海马和皮层区的阳性斑块面积与阳性对照组相比分别减少了80%以上(P<0.05),IgG IN组分别减少了50%以上(P<0.05),IgG IV组分别减少了37.09%和52.59%(P<0.05)。J20小鼠的脑内Ap斑块体内抑制试验选用16只7月龄的小鼠,分为CB-IgG IN组、IgG IN组、阳性对照组和阴性对照组。CB-IgG IN组和IgG IN组的小鼠经鼻腔5天给予一次抗体,10周后,免疫组织化学染色观察各组小鼠脑内的Aβ沉积和淀粉样斑块。CB-IgG IN组小鼠脑内Ap斑块的体积和数量均显著减少(P<0.05),与阳性对照组比,海马和皮层区阳性斑块的面积分别减少了71.77%和73.08%(P<0.05)。IgG IN组小鼠脑内Ap斑块的数量的减少与阳性对照组相比无统计学差异(P>0.05),海马区阳性斑块的面积与阳性对照组比无统计学差异(P>0.05),皮层区减少了38.63%(P<0.05)。以上实验可证明,Ap多肽抗体偶联CB经鼻腔给予可以绕开血脑屏障进入大脑,其抗体入脑量、抑制痴呆模型鼠脑内Aβ沉积和淀粉样斑块形成、改善学习记忆能力等多项效果均优于未偶联Ap多肽抗体的鼻腔给药或其它途径和措施,为AD免疫治疗的研究提供了有效的途径和新的思路。