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目的本文旨在探究LSD1在人卵巢癌细胞自噬中的作用,并揭示其参与自噬过程的具体调控机制,为探寻新的卵巢癌发病机制和潜在的分子靶向治疗方案提供数据支撑和理论基础。方法1.采用慢病毒转染的方法用卵巢癌HO8910细胞株构建稳定传代的诱导型敲减LSD1的细胞模型,Western blotting和qRT-PCR观察LSD1的敲减程度及其特异性底物H3K4me2水平的变化。2.Western blotting方法检测敲减LSD1表达和抑制LSD1酶活性对自噬相关蛋白Beclin1和LC3蛋白表达的影响。3.qRT-PCR检测敲减和抑制LSD1对自噬相关基因LC3 mRNA表达水平的影响。4.免疫荧光技术(Immunofluorescence)观察敲低LSD1表达或抑制LSD1酶活性后内源性LC3的表达及聚集变化,进而探讨LSD1与细胞自噬发生的关系。5.GFP-LC3单荧光体系示踪技术将GFP-LC3质粒转染入LSD1敲低或抑制的HO8910细胞株内,观察GFP-LC3为代表的外源性自噬小体的聚集情况。6.无血清的DMEM(饥饿)和雷帕霉素(Rapamycin)诱导HO8910细胞自噬发生,利用Western blotting检测在自噬状态下LSD1的表达变化,进一步佐证LSD1在卵巢癌细胞自噬中的作用。7.Western blotting检测敲减LSD1表达对mTOR活性的影响,然后利用mTOR的激活剂MHY1485激活mTOR信号,进一步检测LSD1调控细胞自噬与mTOR信号通路的依赖关系,从而探讨LSD1影响卵巢癌细胞自噬的作用机制。结果1.本研究通过慢病毒介导在卵巢癌HO8910细胞株内稳定诱导敲低LSD1的方法效果显著,在Dox诱导下,LSD1的表达在转录(mRNA)和翻译(蛋白质)水平均显著降低,且降低程度与Dox呈时间剂量依赖性方式;相反,LSD1的特异性甲基化底物H3K4me2的表达水平显著增高,表明诱导型稳定敲低LSD1表达的HO8910细胞株成功建立,为后续实验提供了稳定高效的细胞模型。2.Western blotting结果显示敲低LSD1表达或抑制LSD1酶活性导致自噬标志蛋白LC3-Ⅱ蛋白水平显著升高,且蛋白升高的趋势与Dox呈时间剂量依赖性方式,而并不影响另一自噬相关蛋白Beclin1的蛋白表达。另外,qRT-PCR结果显示,LSD1表达或酶活性受抑后,LC3 mRNA表达水平并无变化。3.Western blotting和免疫荧光结果显示LSD1的敲低或抑制显著诱导HO8910细胞自噬的发生。4.血清饥饿和雷帕霉素诱导自噬发生后,HO8910细胞内LSD1蛋白的表达被明显抑制;用Dox诱导LSD1下调后,导致饥饿和雷帕霉素诱导的自噬通量进一步累积,提示LSD1可能涉及饥饿和雷帕霉素诱导自噬的过程,且LSD1的表达受到饥饿或雷帕霉素这两种自噬刺激因素的负反馈调节。5.LSD1的下调或抑制可以引起mTOR信号通路失活,从而导致细胞自噬水平上调,用MHY1485激活mTOR信号后,LSD1下调所导致的自噬激活被阻断,表明LSD1下调诱导的细胞自噬是通过抑制mTOR信号通路实现的。结论1.LSD1在卵巢癌HO8910细胞中负向调控细胞自噬的发生;2.通过sh RNA技术敲低LSD1或药物性抑制LSD1酶活性能够诱导细胞自噬的发生,刺激自噬流的累积;3.干扰LSD1表达显著增强饥饿或雷帕霉素诱导的自噬,且LSD1的表达受自噬刺激因素的负反馈调节;4.LSD1调节卵巢癌细胞自噬的过程依赖于对mTOR信号通路的调控。