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镰形扇头蜱可传播牛的巴贝斯虫病等,是我国南方的优势蜱种。其唾液腺是重要器官,在吸血过程中分泌大量的功能分子,这些功能分子成为最有价值的候选疫苗抗原分子。本文通过对镰形扇头蜱唾液腺及其表达序列标签(EST)研究,旨在寻找抗蜱及蜱传病疫苗的抗原候选分子。 本研究选择温度为25℃、相对湿度为92%的条件进行镰形扇头蜱兔体的人工饲养和繁殖,获得单雌蜱克隆蜱群。解剖镰形扇头蜱,取其唾液腺,经液氮反复冻融、超声、离心获得唾液腺提取物(SGE)。将含量为10μg的镰形扇头蜱未吸血和半饱血SGE进行SDS-PAGE,发现二者蛋白表达存在明显差异,主蛋白条带分别为69kDa、100kDa,吸血后蛋白表达发生变化,在分子量为45-100kDa间产生一些新的蛋白分子。将蛋白抗原转印到PVDF膜,用被镰形扇头蜱三次叮咬的兔抗血清进行Western-blotting分析,发现35kDa的蛋白可能是较重要的抗原,100kDa蛋白是蜱吸血时产生的新抗原。用半饱血SGE抗原经间接ELISA法检测人工感染的镰形扇头蜱幼虫、若虫、成虫的免抗蜱唾液抗体的变化情况,发现被蜱叮咬的兔抗体效价随着叮咬次数的增加而增加。通过Smart方法结合长链PCR(LD-PCR)构建了高质量的镰形扇头蜱半饱血唾液腺cDNA广西大学硕士论文镰形扇头蝉唾液腺及其表达序列标签的研究文库,文库重组率为95.2%,插入片段多在0.5一Zkb之间,库容量为2、75X106pfu/mL,为分离有价值的基因提供了资源及平台。经大肠杆菌BM25.8质粒化,从eDNA文库获得1 00条平均长度为745bp的有效ESTs,经功能分析发现,分别与能量代谢、信号传导、蛋白合成等基因相关,Es丁s中有27%的未知新基因,2条分别为ATP酶、细胞色素氧化酶m蛋白的全长基因,并登录在Ge心ankTM上,登录号分别为AY319968、AY422796;同时在ESTs中还发现一些抑制分子、粘合素蛋白等有价值的ESTs。 通过研究,发现了镰形扇头蜂唾液腺的重要蛋白抗原;构建了国内第一个镰形扇头蟀唾液腺cDNA文库,并运用EST技术获得了新基因,为蟀的相关研究提供了平台,为控制蟀及蟀传病奠定了基础。