再生障碍性贫血(AA)是由多种病因、多种发病机理引起的骨髓造血功能衰竭、造血细胞数量减少所引发的,以贫血、出血和感染为主要症状的一组异质性疾病。再障发病机理较为复杂,以往认为再障的发生与造血干细胞损伤、造血微环境缺陷及免疫介导有关,三种机制在不同的患者个体中单独或联合作用,导致造血功能衰竭。近年来越来越多的学者认识到细胞免疫功能紊乱在再障发病中起着重要作用,已成为再障基础研究方面一个最活跃的领域。近年来的研究已发现AA患者不仅存在T细胞数量的异常,其功能和表型也有明显改变。新近的研究则进一步证实,AA患者体内不但淋巴细胞异常活化,淋巴细胞极化明显异常,Thl表型细胞比例显著增多,尤其产生的负性造血调控因子如γ-干扰素和肿瘤坏死因子-α含量升高。在AA小鼠动物模型的研究中也同样证实其体内存在异常活化的淋巴细胞,使用ATG、CSA及抗IFN-Y或抗TNF-a单抗治疗有效,同时发现该类小鼠造血功能衰竭主要与Fas介导的造血干／祖细胞凋亡有关,并由此提出获得性再生障碍性贫血是由T细胞介导的器官特异性细胞毒T细胞针对自身CD34+造血干／祖细胞的一种自身免疫性疾病。因此,继续深入探讨免疫学发病机理具有重要的理论意义和实用价值。共刺激分子LIGHT、 HVEM是一对近年来研究比较多的共刺激分子,LIGHT与HVEM结合后可促进T细胞活化、增殖、产生细胞因子及发挥相应的生物学效应。LIGHT/HVEM信号在细胞免疫应答过程中具有重要作用,是一个免疫治疗的靶分子。最近的研究发现LIGHT信号与一些自身免疫性疾病相关,主要包括关节炎、动脉粥样硬化、肠炎。转基因小鼠研究表明LIGHT在T细胞上表达会导致淋巴细胞活化,炎症反应,集中在肠粘膜组织的组织损伤。相对地,破坏LTβ/LIGHT信号转导在自身免疫性疾病动物模型中被证实可减轻炎症反应,LIGHT基因的敲除可以阻止一些T细胞介导的疾病的进展,如胰岛素依赖型糖尿病,炎症性肠病,急性自身脑脊髓膜炎,GVHD。我们利用Peromyscus leucopus.linville(PLL)成功建立免疫介导的再生障碍性贫血动物模型,利用再生障碍性贫血模型进行LIGHT表达的测定,并应用LIGHT单抗取得了再生障碍性贫血治疗的显著疗效,利用RNA干扰技术,下调LIGHT基因表达,使再障发病进程得到改善。同样的现象我们在再障患者中得到了验证,我们通过提取再障患者的外周血淋巴细胞,观察LIGHT的表达,均发现再障治疗前后,LIGHT表达有明显的差异。所以我们的实验主要探讨了LIGHT信号分子在再生障碍性贫血发生过程中的作用,并且我们有理由相信LIGHT在再障发病进程中起着重要作用。一.peromyscus leucopus的生物学特性，及其在造血系统疾病研究中的作用Peromyscus leucopus,是一种有着白色爪子的鼠,是北美地区最常见的野生鼠种群。它和我们常见的实验用鼠MMB6从体型及外貌都非常相似。它是人类很多疾病的传播者。最新对于Peromyscus.leucopus的研究兴趣是因为认为这物种可能是研究血液系统疾病的理想动物模型,目的：研究Peromyscus leucopus的生物学特性,了解其外周血象,骨髓象,病理特点,及利用此动物进行再生障碍性贫血模型建立的研究,以探索其在血液系统疾病研究中的作用,方法：参照文献方法,将Peromyscus leucopus(PLL)小鼠分成三组,2-6月为年轻组,7-15月为中年组,>15月为老年组。分别进行血常规、骨髓细胞、脾脏细胞计数,以及骨髓、肺、脾脏、肝脏的病理检测,予NAC干预后,检测ROS表达。分离正常父系PLL的淋巴细胞,调整细胞数为20-50×106/L,先接受5GyTBI,从尾静脉注射入F1代小鼠,通过血常规、骨髓检测,以证实再生障碍性贫血动物模型的建立。结果：我们检测了全血细胞计数,骨髓细胞和脾脏细胞计数,骨髓、脾脏、肝脏和肺脏的病理和外周血流式细胞检测。我们发现Peromyscus.leucopus外周血有更低的血小板计数,更接近于人类血小板值,骨髓中更少的巨核细胞,这可能更适合用于研究人类血小板减少疾病。老年组表现为血红蛋白(Hb)、红细胞压积(Hct)下降,但血小板会增加,这点与年龄相关的血象变化,同人类血液变化相似。骨髓细胞和脾脏细胞计数较MMB6明显减低,脾脏重量也显著小于MMB6,鼠源抗体CD3、CD4、CD8、CD44和CD45R可适用于PLL。PLL的淋巴细胞适用N—乙酰—L—半胱氨酸(NAC)证实PLL良好的抗氧化效应。通过血常规、骨髓象证实,成功建立了免疫介导的再生障碍性贫血模型。结论：PLL的生物学特征更接近于人类,尤其是血象表现接近与人类,今后可以将其作为研究血液疾病更好的动物模型。二.LIGHT表达及变化与再生障碍性贫血发生发展间关系的研究目的：研究LIGHT信号分子在再生障碍性贫血模型中的表达,及LIGHT单抗在模型中的治疗作用。体外阻断LIGHT的表达,观察再障发病进程的改变。方法：将实验动物分三组,一组对照组,小鼠接受5Gy全身照射(TBI),第二组TBI+淋巴细胞输注组(模型组),实验小鼠接受5GyTBI,并输注5×106/L父系淋巴细胞。第三组TBI+淋巴细胞+LIGHT单抗,实验小鼠接受5GyTBI,予当天接受5×106/L父系淋巴细胞输注,并于输注后d1、2、3、4、5连续接受100ul/dLIGHT单抗输注,于第14天进行骨髓细胞计数,骨髓、肝脏、脾脏、肠道等病理检测。将父系淋巴细胞进行LIGHT基因的RNA干扰,再回输给F1代小鼠,通过外周血象及骨髓象的改变,观察再生障碍性贫血发病进程的改变。结果：TBI+淋巴细胞输注组白细胞(WBC)、中性粒细胞下降明显,淋巴细胞比例明显增高,输注LIGHT单抗后中性粒细胞、淋巴细胞回升,血小板上升。骨髓细胞行流式细胞检测,发现代表T细胞活化的CD3-比例在淋巴细胞输注组明显升高,CD3+CD8+比例相较对照组明显升高,LIGHT表达在再障组亦升高,造血干细胞表达在淋巴细胞输注组显著降低,而LIGHT组造血干细胞出现明显的回升。接受父系淋巴细胞后,干扰组的血象同正常值相比无明显变化,模型组血象明显下降,以白细胞、淋巴细胞、血小板下降最明显,骨髓病理比较,干扰组造血细胞可见,骨髓增生活跃,而模型组骨髓增生低下,巨核细胞减少,脂肪细胞易见。结论：LIGHT信号分子在再障发病过程中起着重要作用,随着LIGHT单抗的应用和特异性阻断LIGHT,均发现再障的血象及骨髓象有所恢复。三.再生障碍性贫血患者LIGHT分子表达的变化目的：检测正常成人、重型再生障碍性贫血、非重型再生障碍性贫血患者外周血LIGHT的表达,及再障患者经免疫抑制治疗前后LIGHT的对比,观擦LIGHT的改变同再障疗效的关系。方法：留取我院血液内科自2011年4月至2012年2月间确诊的再生障碍性贫血患者,共10例,收集再生障碍性贫血外周血,分离获得淋巴细胞,流式检测淋巴细胞上LIGHT的表达,提取正常对照、重型再障治疗前,经ATG治疗后3月外周血T淋巴细胞总mRNA,检测活化T细胞LIGHT分子基因表达。结果：重型再障外周血LIGHT分子表达明显高于正常对照,非重型再障,重型再障为25.4±3.4%,非重型再障患者为16.4±4.7%,而正常对照仅为5.8±1.6%。重型再障患者LIGHT mRNA明显高于正常组,在治疗后3月,出现LIGHT信号分子的明显下调,血象出现恢复迹象。结论：LIGHT表达上调与再生障碍性贫血的发生存在相关性,通过再障患者治疗前后LIGHT信号分子表达的改变,可以确定LIGHT信号分子在再障发病进程中起重要作用。