富硒丹参内酸溶蛋白提取方法及抗氧化活性研究

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丹参(Salvia miltiorrhiza Bge.)是一种唇形科鼠尾草植物,是我国常用的活血化瘀中药之一,对心脑血管、肿瘤、癌症等疾病具有治疗作用。硒是人和动物必需的微量元素之一,在机体内主要作为谷胱甘肽过氧化物酶的活性中心,参与机体内的抗氧化作用,清除过氧化物等有毒的物质。丹参和硒都具有抗氧化活性,但作用机理不同。丹参抗氧化活性主要源自于其丹参酮类、酚酸类和黄酮类与活性氧直接发生化学反应。而硒则通过与人体内酶结合发挥内源性的抗氧化作用。人体内丹参有效成分和硒酶的联合作用可能在疾病治疗中产生协同作用。中江地处我国土壤缺硒地带,富硒栽培可有效提高丹参硒含量。对丹参根内蛋白质和硒蛋白提取方法进行了优化。而为了评价富硒对丹参抗氧化活性的影响,本文采用体外和体内实验评价富硒丹参的抗氧化活性。采用Box-Behnken试验设计探究不同p H值,不同提取次数,不同液固比对提取丹参根内蛋白质和硒蛋白含量的影响。试验结果丹参根内蛋白质的最优提取工艺条件为p H=6.25,重复提取3次,液固比为35 m L/g。验证丹参蛋白质为1.26g/100 g与模型相差2.4%;且发现酸性缓冲溶液不能提取出含硒的蛋白质。本文采用富硒栽培采用田间叶面喷施亚硒酸钠和硒酸钠溶液的方式,实验设置亚硒酸钠和硒酸钠低、中、高剂量组(Se浓度分别为0.060、0.120、0.240 g/L),以及未喷施硒的空白对照组,每个剂量处置平行3组。丹参收获后分拣为根、茎和叶。用不同体积分数(32%、42%、90%)的乙醇超声提取法得到丹参根、茎、叶的水溶性成分和脂溶性成分,分别采用铁氰化钾法、邻二氮菲-Fe2+法、邻苯三酚自氧化法、DPPH法和ABTS法测定丹参植株水溶性成分和脂溶性成分的体外抗氧化活性,评价富集不同剂量和不同硒酸盐丹参植株体外抗氧化活性的差异。5种体外抗氧化活性评价实验均显示,丹参根的所有富硒剂量组之间以及与对照组之间的差异不显著。亚硒酸钠低剂量组的丹参茎和叶的乙醇提取物抗氧化活性高于对照组(P<0.05),其他的富硒组丹参茎叶的抗氧化活性大多高于对照组,但是田间平行实验组的数据波动较大,而使得这些组未表现出显著性差异。通过对比丹参植株内总酚酸、总黄酮和总丹参酮的含量,丹参乙醇提取物的体外抗氧化活性与丹参次生代谢产物含量呈正相关关系,因此体外抗氧化活性实验反映的是丹参次生代谢产物的抗氧化活性。为了全面评价丹参植株次生代谢产物和硒化合物的抗氧化活性,采用SD大鼠心肌缺血再灌注模型法测定丹参根提取物的抗氧化活性。采用体积分数为32%、42%、90%的乙醇溶液和0.05 mol/L Na OH连续提取丹参次生代谢产物和硒化合物浓缩成浸膏,每克浸膏相当于原药1克。实验设定假手术组、心肌缺血模型组、丹参组、丹参+Na2Se O3溶液组、丹参+Na2Se O4溶液组、富Se(Ⅳ)丹参组、富Se(Ⅵ)丹参组,每组大鼠10只。按每千克体重5 g浸膏连续灌胃7 d后,测定大鼠左心室收缩最高压(LVSP)、左心室舒张最低压(LVDP)和左心室内压最大变化速率(dp/dt Max)、左心室内压最小变化速率(dp/dt Min)等血流动力学参数,测定大鼠心肌缺血再灌注4 h后血清内肌酸激酸同工酶(CK-MB)、乳酸脱氢酶(LDH)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、丙二醛(MDA)、一氧化氮(NO)的活性或含量,评价丹参提取物、丹参提取物添加无机硒和富集不同硒酸盐的丹参根提取物的大鼠体内抗氧化活性差异。实验发现,灌胃丹参浸膏的大鼠相比未灌胃的大鼠升高了LVSP、dp/dt Max、dp/dt Min水平,降低了LVDP水平,表明丹参能够明显改善大鼠心脏功能。富Se(Ⅳ)丹参组、富Se(Ⅵ)丹参组、丹参+Na2Se O4组相比心肌缺血模型组和丹参组SOD、GSH-Px活性、NO含量升高,CK-MB、LDH活性、MDA含量降低。而丹参+Na2Se O3组相比心肌缺血模型组和丹参组SOD、GSH-Px活性降低,CK-MB、LDH活性升高,NO、MDA含量升高,表明无机Na2Se O3在安全剂量范围内对大鼠心肌存在损伤作用。不同丹参浸膏对大鼠心肌缺血损伤抑制作用的大小表现为富Se(Ⅳ)丹参组>富Se(Ⅵ)丹参组>丹参+Na2Se O4组>丹参组>心肌缺血模型组~丹参+Na2Se O3组。由此得出富硒丹参的次生代谢产物和硒化合物能共同作用于大鼠,在心肌缺血抗氧化作用中表现出协同作用。
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