目的：糖尿病肾病（diabetic nephropathy，DN）是糖尿病（diabetesmellitus，DM）最常见的微血管并发症之一，是目前我国慢性肾衰竭的主要原因之一，探寻DN发病机制及有效防治措施的意义不言而喻。中医药在防控DN方面，已显现出较大优势。现代中医肾病学者大多认为，DN除有DM“气阴两虚”的病机外，其主要病机是瘀血阻于肾络，DN治疗多遵循活血化瘀通络法则，已成为中医肾病领域的共识。现代医学证实，肾素-血管紧张素系统（renin-angiotensin system，RAS）的激活是参与DN发病机制的主要因素，基于对DN过程中RAS经典途径ACE-AngⅡ-AT1通路过度激活的认识，血管紧张素转换酶抑制剂（angiotensin convertingenzyme inhibitor，ACEI）、血管紧张素受体拮抗剂（angiotensin receptorblocker，ARB）已成为现代医学临床治疗和延缓DM肾损害的一线药物。然而，随着对RAS的深入研究发现，RAS的另一条功能轴——ACE2-Ang-(1-7)-Mas轴，可与ACE-AngⅡ-AT1轴相对抗。维持和调整RAS两条代谢通路的平衡成为治疗DM肾脏损伤的新理念。本研究拟以瘀血阻络证候和ACE2-Ang-(1-7)-Mas轴为主要切入点，通过动物实验及小鼠足细胞的离体培养，探索DN瘀血阻络证是否与RAS中ACE2-Ang-(1-7)-Mas轴功能失调存在关联，以及化瘀通络中药对DN瘀血阻络证的干预作用是否同时改善ACE2-Ang-(1-7)-Mas轴的功能失调。方法：1糖尿病肾病大鼠瘀血阻络证的确认健康雄性SD大鼠32只，4w龄，80～100g，适应性喂养1w后，随机分为空白对照组（C组，n=8）、高糖高脂对照组（H组，n=10）和模型组（M组，n=14），C组大鼠予普通全价颗粒饲料喂养，其余大鼠均予高糖高脂饲料喂养。4w后，M组大鼠腹腔注射1%链脲佐菌素（streptozotocin，STZ）溶液（40mg/kg体重），72h后随机血糖≥16.7mmol/L为DM大鼠模型复制成功；C、H两组大鼠均腹腔注射相应体积的0.1M枸橼酸缓冲液。于注射STZ后第3d、4w、8w、16w末，测量各组大鼠的随机血糖。16w末收集大鼠24h尿液（检测尿蛋白定量）后，麻醉状态下腹主动脉取血，检测各组大鼠血液流变学指标、血脂和血小板参数，留取各组大鼠肾皮质，行光镜、透射电镜观察。2化瘀通络中药对糖尿病肾病大鼠瘀血阻络证的干预作用将实验大鼠40只，随机分为C组（n=10）和STZ注射组（n=30）。STZ注射组的模型复制方法同上。将模型复制成功的25只DM大鼠分为M组（n=12）和化瘀通络中药组（Z组，n=13）。用药剂量按照成人临床常用剂量的5.8倍计算，给予Z组大鼠中药颗粒剂混悬液灌胃（1.08g/kg体重，相当于饮片4.7g/kg体重），其余组大鼠给予相应体积饮用水灌胃，每日1次，连续16w。16w末，腹主动脉取血，检测各组大鼠血液流变学指标、血脂、血小板参数、血浆纤维连接蛋白（fibronectin，FN）含量（ELISA法），并冻存部分肾皮质，采用实时荧光定量PCR（real-time PCR）检测组织型纤溶酶原激活物（tissue plasminogen activator，t-PA）、纤溶酶原激活物抑制剂-1（plasminogen activator inhibitor-1，PAI-1）mRNA的表达。3糖尿病肾病瘀血阻络证大鼠肾皮质ACE2-Ang-(1-7)-Mas轴的变化及化瘀通络中药的干预作用将实验大鼠93只，随机分为C组（n=22）和STZ注射组（n=71），模型复制方法同上，将成模DM大鼠62只随机分为M组（n=24）、厄贝沙坦组（I组，n=19）和Z组（n=19），给予相应药物灌胃干预。于注射STZ后4w末随机取C组、M组大鼠各6只处死，其余各组大鼠分别于8w、16w末分两次处死，取肾皮质组织，采用免疫组织化学法和蛋白印迹（western blot）检测肾皮质ACE2、Mas、ACE蛋白的表达，real-time PCR检测肾皮质ACE2、Mas、ACE mRNA的表达，ELISA法检测肾皮质Ang-(1-7)的含量。4化瘀通络中药对糖尿病肾病瘀血阻络证肾损伤的干预作用将实验大鼠57只，随机分为C组（n=10）和STZ注射组（n=47），模型复制、成模DM大鼠分组及干预方法同上。于注射STZ后第3d、4w、8w、16w末，动态计量各组大鼠体重、24h摄食量、饮水量、尿量和24h尿蛋白定量。16w末处死动物，腹主动脉取血，检测肾功能；称量肾重，计算肾脏指数（kidney index，KI）；留取肾皮质，通过光镜、透射电镜检测各组大鼠肾脏病理表现。5化瘀通络中药对高糖刺激下足细胞的干预作用将许可条件下培养的条件性永生化小鼠足细胞分为正常糖组（NG组）、高糖组（HG组）和12个药物浓度的高糖加药组分别给予相应干预24h、48h、72h，通过MTT试验观察不同药物浓度对高糖刺激下细胞增殖的影响，对比结果筛选最佳药物浓度。将非许可条件下分化成熟的小鼠足细胞分为NG组、HG组和最佳药物浓度的高糖加药组[(HG+Z)组]，分别给予相应干预24h、48h、72h，检测细胞上清液Ⅳ型胶原蛋白（collagen-Ⅳ，Col-Ⅳ）的含量；采用免疫细胞化学法和western blot检测足细胞ACE和ACE2蛋白的表达，real-time PCR检测足细胞ACE、ACE2mRNA的表达。结果：1糖尿病肾病大鼠瘀血阻络证的确认1.1一般情况与C、H两组大鼠比较，M组大鼠逐渐出现多饮、多食、多尿及体重降低的表现。C组大鼠爪心红润，尾部静脉暗红不显；H组与C组差异不明显；而M组大鼠爪心紫暗，尾部静脉深紫而清晰可见。1.2随机血糖C、H两组大鼠的血糖基本恒定，H组大鼠的血糖高于C组（P<0.01）；腹腔注射STZ后，M组血糖水平显著高于同时间点C、H两组（P<0.01）。1.324h尿蛋白定量16w末，C、H两组间UPE无统计学差异（P>0.05）；与C、H两组比较，M组大鼠尿蛋白显著增加（P<0.01）。1.4病理形态学C、H两组大鼠肾脏体积正常，表面光滑，肾小球结构正常、清晰，足突排列整齐、无融合；M组大鼠肾脏体积增大，表面不平滑且有苍白花斑，肾小球肿胀肥大，基底膜均质性增厚且结构杂乱，系膜基质增多，足突节段性融合。1.5血液流变学指标16w末，H组仅红细胞压积（hematocrit，HCT）低于C组（P<0.05）。与C组比较，M组大鼠各切变率全血粘度、血浆粘度和全血低切还原粘度均明显升高（P<0.01），HCT、红细胞变形指数（erythrocyte deformabilityindex，EDI）均明显降低（P<0.05或0.01）；其中，全血粘度、血浆粘度和EDI还同时与H组具有统计学差异（P<0.05或0.01）。1.6血脂16w末，H组血总胆固醇（total cholesterol，TC）、低密度脂蛋白（lowdensity lipid cholesterol， LDL）和高密度脂蛋白（high density lipidcholesterol，HDL）均高于C组（P<0.05或0.01），而甘油三酯（triglyceride，TG）和极低密度脂蛋白（very low density lipid cholesterol，VLDL）则与C组无明显差异（P>0.05）。与C、H两组比较，M组大鼠TC、TG、LDL、HDL和VLDL均明显升高（P<0.01）。1.7血小板参数16w末，H组仅平均血小板体积（mean platelet volume，MPV）高于C组（P<0.05）。与C组比较，M组血小板计数（platelet count，PLT）明显减少（P<0.01），MPV和血小板分布宽度（platelet distributing width，PDW）显著增高（P<0.01）；其中，PLT、MPV同时与H组具有显著差异（P<0.05或0.01）。各组间大型血小板比率（platelet-large cell ratio，P-LCR）无明显差异（P>0.05）。2化瘀通络中药对糖尿病肾病大鼠瘀血阻络证的干预作用2.1一般情况C组大鼠爪心红润，尾部静脉暗红不显；M组大鼠爪心紫暗，尾部静脉深紫而清晰可见；I、Z两组大鼠爪心和尾部静脉较M组有所改善。2.2血液流变学指标16w末，与C组比较，M组大鼠各切变率全血粘度、血浆粘度和全血低切还原粘度均明显升高（P<0.01），HCT、红细胞变形指数（erythrocytedeformability index，EDI）均明显降低（P<0.01）；与M组比较，Z组切变率30S-1、200S-1全血粘度、血浆粘度和EDI均有显著改善（P<0.05或0.01）。2.3血脂16w末，与C组比较，M组大鼠TC、TG、LDL、HDL和VLDL均明显升高（P<0.01）。与M组比较，Z组以上各血脂指标均显著降低（P<0.05或0.01）。2.4血小板参数16w末，与C组比较，M组血小板计数（platelet count，PLT）明显减少（P<0.01），MPV和血小板分布宽度（platelet distributing width，PDW）显著增高（P<0.05或0.01）；与M组比较，Z组MPV、PDW均明显降低（P<0.01）。各组间大型血小板比率（platelet-large cell ratio，P-LCR）无明显差异（P>0.05）。2.5血浆FN含量16w末，M组血浆FN含量明显高于C组（P<0.01）；与M组比较，Z组含量明显降低（P<0.05）。2.6肾皮质t-PA、PAI-1mRNA的表达16w末，各组t-PA mRNA的表达无明显差异（P>0.05）；M组PAI-1mRNA的表达显著高于C组（P<0.05），而Z组的表达低于M组（P<0.05）。3糖尿病肾病瘀血阻络证大鼠肾皮质ACE2-Ang-(1-7)-Mas轴的变化及化瘀通络中药的干预作用3.1肾皮质ACE2、Mas、ACE的表达ACE2和ACE主要表达在各组大鼠肾小球和肾小管的上皮细胞中，Mas主要表达在各组大鼠肾皮质组织的近端小管。C组大鼠各时间点肾皮质ACE2、Mas和ACE蛋白的表达均无显著差异（P>0.05）。M组大鼠肾皮质ACE2、Mas蛋白的表达均随时间呈现降低趋势：16w末ACE2蛋白的表达低于4w末（P<0.05）；16w末Mas蛋白的表达分别低于4w末和8w末（P<0.05或0.01）。M组不同时间点ACE蛋白的表达无统计学差异（P>0.05）。8w末，ACE2和Mas蛋白在各组大鼠肾皮质组织的表达水平，无统计学差异（P>0.05）；ACE蛋白的表达水平仅在M、I两组间存在差异（P<0.05）。16w末，肾皮质ACE2蛋白的表达，M组低于C组（P<0.01），I、Z两组均高于M组（P<0.05），且Z组高于I组（P<0.05）；Mas蛋白的表达，M组低于C组（P<0.05）；I、Z两组均高于M组（P<0.01）。ACE蛋白的表达，M组显著高于C组（P<0.01）；Z组低于M、I两组（P<0.05或0.01）。3.2肾皮质ACE2、Mas、ACE mRNA的表达以4w末C组大鼠作为参照，进行相对表达定量。C组大鼠各时间点肾皮质ACE2、Mas、ACE mRNA的表达无显著差异（P>0.05）。M组各时间点ACE2mRNA的表达均低于同时间点C组（P<0.01），在4w至16w之间先上升（P<0.01）、后下降（P<0.05）；M组Mas mRNA的表达在4w高于C组（P<0.01），在4w至16w之间持续下降（P<0.01），16w低于C组（P<0.05）；M组ACE mRNA的表达在4w低于C组（P<0.01），在4w至16w之间先上升（P<0.01）、后下降（P<0.05），8w、16w均高于C组（P<0.05或0.01）。8w末，各组Mas mRNA的表达无显著差异（P>0.05）。与C组比较，M组ACE2mRNA的表达显著降低（P<0.01），ACE mRNA的表达显著升高（P<0.01）；与M组比较，Z组ACE2mRNA的表达显著升高（P<0.01），且高于I组（P<0.05）；I、Z两组ACE mRNA的表达均低于M组（P<0.05）。16w末，与C组比较，M组ACE2mRNA的表达显著降低（P<0.01），ACE mRNA的表达显著升高（P<0.05），而Mas mRNA的表达无显著差异（P>0.05）；与M组比较，Z组ACE2和Mas mRNA的表达均显著升高（P<0.05或0.01）；其中， Z组Mas mRNA的表达还同时高于I组（P<0.05）；M、I、Z三组间ACE mRNA的表达差异不明显（P>0.05）。3.3肾皮质Ang-(1-7)的含量16w末，与C组比较，M组大鼠的肾皮质Ang-(1-7)含量明显降低（P<0.01）；而I、Z两组的Ang-(1-7)含量均高于M组（P<0.01）。3.4M组大鼠血液粘度与ACE2、Mas和ACE mRNA及其蛋白表达的线性相关分析16w末，M组大鼠血浆粘度和不同切变率下全血粘度与肾皮质ACE2mRNA及其蛋白的表达均呈负相关（P<0.05或0.01），与ACE mRNA及其蛋白的表达均呈正相关（P<0.05或0.01）；而与Mas mRNA及其蛋白的表达无显著线性相关关系（P>0.05）。4化瘀通络中药对糖尿病肾病瘀血阻络证肾损伤的干预作用4.1糖尿病症状性指标的动态变化腹腔注射STZ4w后，M组大鼠各时间点体重均明显低于同时间点C组（P<0.01）；16w末，I、Z两组体重均明显高于M组（P<0.05或0.01）。与同时间点C组比较， M组各时间点RBG、24h摄食热量、饮水量和尿量均显著升高（P<0.01）；与同时间点M组比较，I、Z两组各时间点RBG、24h摄食热量和尿量均无明显差异（P>0.05），仅8w末I、Z两组和16w末Z组24h饮水量显著低于同时间点M组（P<0.05或0.01）。4.224h尿蛋白定量的动态变化M组大鼠各时间点尿蛋白均高于同时间点C组（P<0.01）；8w末，I、Z两组尿蛋白明显低于M组（P<0.05或0.01）；16w末，Z组显著低于M、I两组（P<0.05或0.01）。4.3肾功能16w末，M组血肌酐（serum creatinine，Scr）、尿素氮（blood ureanitrogen，BUN）、尿酸（uric acid，UA）均高于C组（P<0.01）；与M组比较，I、Z两组Scr、BUN均有显著改善（P<0.05或0.01），Z组UA也低于M组（P<0.05）。4.4肾脏指数16w末，M组KI值明显高于C组（P<0.01）；而I、Z两组KI值均显著低于M组（P<0.05）。4.5光镜观察肾皮质结构C组肾皮质结构正常；M组肾小球肾小球体积肥大，基底膜轻度增厚，系膜轻度增生，毛细血管管腔扩张，肾小囊腔狭窄，肾小管上皮细胞排列紊乱、肥大；I、Z两组的肾小囊腔较宽，系膜增生有所改善。4.6透射电镜观察肾小球超微结构C组肾小球超微结构基本正常；M组大鼠肾小球基底膜均质性增厚且结构欠清晰，系膜基质增多，足突节段性融合；I、Z两组结构较清晰，基底膜节段性增厚，足突少部分融合。5化瘀通络中药对高糖刺激下足细胞的干预作用5.1MTT试验HG组各时间点光密度（optical density，OD）值均明显低于同时间点NG组（P<0.05或0.01）；多个药物浓度均对高糖刺激24h、48h、72h对足细胞的增殖抑制有不同程度的逆转作用，其中，各时间点均以药物浓度100ug/ml的含药高糖组的OD值最高，且高于HG组（P<0.01）。以100ug/ml作为最佳给药浓度。5.2细胞上清液Col-Ⅳ的含量给予足细胞不同干预24h后，各组细胞上清液Col-Ⅳ的含量无显著差异（P>0.05）；不同干预48h、72h后，HG组细胞上清液Col-Ⅳ的含量均高于同时间点NG组（P<0.01），而(HG+Z)组干预48h后Col-Ⅳ的含量显著低于HG组（P<0.05）。5.3足细胞ACE、ACE2蛋白的表达ACE和ACE2蛋白特异性表达于足细胞胞浆中。不同干预48h，与NG组比较，HG组ACE蛋白表达显著升高（P<0.05），ACE2蛋白表达显著降低（P<0.01）；与HG组比较，(HG+Z)组ACE蛋白表达较低，而ACE2蛋白表达较高（P<0.05）。而不同干预24h、72h后，各组ACE2、ACE蛋白的表达均无明显差异（P>0.05）。5.4足细胞ACE、ACE2mRNA的表达分别与同时间点NG组比较， HG组各时间点ACE mRNA表达均显著升高（P<0.05），HG组24h、48h ACE2mRNA表达显著降低（P<0.05或0.01）；分别与同时间点HG组比较，仅48h (HG+Z)组ACE mRNA表达明显降低，ACE2mRNA表达明显升高（P<0.01）。结论：1DN大鼠爪掌、尾静脉有紫暗瘀血表现，血液存在高粘、高凝状态，与瘀血阻络的中医证候特征相符，确认了DN瘀血阻络证的存在。2化瘀通络中药对DN大鼠瘀血阻于肾络的证候具有良性调节作用。3DN大鼠肾皮质ACE2-Ang-(1-7)-Mas轴功能下调，化瘀通络干预16w可不同程度上调其功能，且作用优于对照药物厄贝沙坦。4化瘀通络中药能有效减轻DN瘀血阻络证大鼠的肾损伤，且作用略优于对照药物厄贝沙坦。5高糖刺激对小鼠足细胞具有抑制增殖、促进Col-Ⅳ分泌、上调ACE、下调ACE2表达的效应；化瘀通络中药干预48h能不同程度逆转以上效应。