目的:肛门直肠畸形（anorectal malformations,ARM）是小儿外科中常见的消化道畸形,发生率约为1/5000¹/1500。目前大部分与ARM相关的疾病可以通过手术治疗,尽管手术效果较好,但术后长期的并发症往往需要患儿长期就医,影响了患儿的生长发育并给家庭造成了严重的负担。研究指出,ARM的病因具有复杂性以及多因素性,遗传因素中的基因突变及信号通路中各信号分子的相互作用和表达调控异常可能与ARM的发生相关。其中,Wnt信号通路在所有与ARM相关的信号通路及网络中占据着重要地位。已经证明Wnt/β-catenin经典信号通路在胚胎发育以及细胞增殖、分化、凋亡等生理过程中发挥着不可替代的作用,而上述生理调节功能也是参与肛门直肠正常分化的重要环节。然而,基因相关的上游分子表达及调控是否与ARM相关仍不十分清楚。环状RNA（circular RNAs,circRNA）是一类新近发现的内源性非编码RNA分子。与线性RNA结构不同,circRNA是闭合的环状分子,缺乏5’–3’极性或多聚核苷酸尾,因此,circRNA具有稳定性、特异性、丰富性和保守性,能够在组织或发育阶段特异性表达。研究指出,circRNA具有许多潜在的功能,可以作为微小RNA（microRNAs,miRNA）的分子海绵发挥竞争性内源RNA（competing endogenous RNAs,ceRNA）的作用;或通过与RNA结合蛋白（RNA binding protein,RBP）或mRNA相互作用,抑制miRNA与靶基因结合或调节mRNA的蛋白翻译;还可以通过调节可变剪接以影响基因的表达或调控亲本基因的转录。CircRNA参与细胞的增殖、分化、凋亡、代谢、衰老等重要的生物学过程,并与多种疾病的发生发展相关。具体而言,circRNA通过不同的机制在神经系统,心血管系统,消化系统和免疫系统疾病以及多种癌症中发挥调节功能。因此,该证据表明circRNA可能用于干预疾病进展或作为新的生物标志物预防或治疗疾病。本研究应用乙烯硫脲（ethylenethiourea,ETU）对Wistar孕鼠进行致畸,建立肛门直肠畸形动物模型。通过高通量测序技术获得与ARM和正常胎鼠肛门直肠发育相关的差异表达的circRNA,验证并筛选出差异显著的rno_circ₀004002,通过转染大鼠肠上皮细胞系（rat intestinal epithelial cells）IEC-6细胞观察rno_circ₀004002对增殖、凋亡及迁移等细胞功能的影响。接下来,在肛门直肠组织中验证rno_circ₀004002、miR-342-5p、Wnt3a在ARM组及正常组中差异表达。通过双荧光素酶报告基因检测及细胞转染验证rno_circ₀004002/miR-342-5p/Wnt3a之间的调控关系,并得到rno_circ₀004002可以通过rno_circ₀004002/miR-342-5p/Wnt3a轴调控细胞功能的改变,为进一步探讨rno_circ₀004002在ARM中的作用及分子调控机制提供科学依据,为将来实现circRNA作为ARM的诊断或治疗生物标志物奠定了重要的基础。研究方法:1、ARM动物模型制备及组织标本收集。雌性（220²50g）和雄性（250³00g）Wistar大鼠以4:1比例午夜合笼,次日清晨阴道涂片,显微镜下观察到精子时定义为妊娠0天（GD0,gestational day 0）。GD10时,给予单剂量125mg/kg的1%ETU（生理盐水溶解）灌胃,制作ARM大鼠动物模型;正常组给予等剂量的生理盐水灌胃。选择GD17、GD19及GD21时,分别按照计划选取一定数量的ARM组和正常组孕鼠,10%水合氯醛（3ml/kg）腹腔注射麻醉孕鼠后剖宫取胎获得胎鼠,若胎鼠无尾或短尾且肛门开口与外界不相通,则纳入ARM组;若胎鼠尾部及肛门开口正常,则纳入正常组。获得的胚胎在解剖显微镜下,无菌条件取ARM组和正常组胎鼠的肛门直肠组织立即在液氮中冷冻,并于-80°C冰箱低温保存,用于高通量测序、qRT-PCR及Western-blot实验。2、通过高通量测序技术筛选GD19时ARM及正常胎鼠的肛门直肠组织中差异表达的circRNA,预测其亲本基因富集的主要功能和信号通路,应用qRT-PCR对差异表达的circRNA进行验证并通过miRanda数据库对其结合的miRNA进行预测。3、通过PCR反向克隆及Sanger测序确定rno_circ₀004002的全长序列。qRTPCR验证rno_circ₀004002在GD17、GD19及GD21时ARM及正常胎鼠肛门直肠组织中的表达差异;在IEC-6细胞中转染siRNA序列或过表达质粒下调或上调rno_circ₀004002的表达,通过CCK-8法、流式细胞术、上皮-间充质转换实验验证rno_circ₀004002对细胞功能的影响。4、利用生物信息学软件及双荧光素酶报告基因检测预测并验证rno_circ₀004002与miR-342-5p,miR-342-5p与Wnt3a的3′UTR（3′Untranslated Regions,3′非翻译区）共享结合位点。在ARM及正常胎鼠的肛门直肠组织中验证miR-342-5p及Wnt3a的表达差异。在细胞内验证rno_circ₀004002与miR-342-5p,miR-342-5p与Wnt3a的负向调控关系,并进一步验证rno_circ₀004002靶向miR-342-5p调控Wnt3a mRNA及蛋白表达,得到rno_circ₀004002靶向rno_circ₀004002/miR-342-5p/Wnt3a轴调控细胞功能。5、统计学分析。实验数据用均值±标准差表示,每组实验数据至少设置三个生物学重复。使用SPSS 21.0和Prism 7.0软件进行统计学处理,采用独立样本t检验和单因素方差分析进行统计学分析,p<0.05表示统计学上有显著差异。结果:1、高通量测序结果提示,GD19时,ARM及正常胎鼠的肛门直肠组织中共得到78个差异表达的circRNA,与正常组相比,ARM组中37个circRNA表达下调,41个circRNA表达上调。富集分析发现,差异circRNA的亲本基因功能主要与氧功能及紧密连接途径相关。使用qRT-PCR验证部分差异circRNA的表达趋势,与测序结果基本一致,但差异倍数有所不同。上述结果表明肛门直肠组织中存在circRNA,并且在ARM和正常胎鼠中具有差异表达的特性。2、对rno_circ₀004002进行全长鉴定,发现rno_circ₀004002在自然界中真实存在,成熟全长序列为410bp。通过qRT-PCR验证其在肛门直肠组织和IEC-6细胞中的表达,结果显示,GD17、GD19及GD21时,rno_circ₀004002在ARM组中较正常组表达下调,并且在GD19和GD21时显著降低;IEC-6细胞中,rno_circ₀004002主要表达于细胞质。细胞功能方面,干扰rno_circ₀004002的表达后抑制细胞增殖,促进细胞凋亡,并通过抑制上皮-间充质转换（epithelial-mesenchymal transition,EMT）而抑制细胞迁移;过表达rno_circ₀004002后促进细胞增殖,抑制细胞凋亡,并通过促进EMT而促进细胞迁移。上述结果提示rno_circ₀004002主要在肛门直肠发育的后期起作用,rno_circ₀004002的表达减少会促进ARM的进展;细胞方面,rno_circ₀004002表达减少时会多方面抑制细胞功能。3、双荧光素酶报告基因检测结果提示,rno_circ₀004002与miR-342-5p,miR-342-5p与Wnt3a的3′UTR共享互补结合位点。在IEC-6细胞内验证得到,rno_circ₀004002可以作为分子海绵负向调控miR-342-5p的表达,Wnt3a是miR-342-5p的直接下游靶基因。与单独干扰rno_circ₀004002的表达相比,在细胞内同时干扰rno_circ₀004002和miR-342-5p的表达后,Wnt3a的表达有所增加,并挽救了对细胞增殖和EMT的抑制以及对细胞凋亡的促进功能。由此我们得到,rno_circ₀004002可以作为miR-342-5p的分子海绵正向调控Wnt3a的表达,并通过rno_circ₀004002/miR-342-5p/Wnt3a轴对细胞功能进行调控。此外,组织学验证提示,与正常组相比,rno_circ₀004002在ARM组中显著下调,miR-342-5p在ARM组中显著上调,Wnt3a在ARM组中显著下调;因此,我们认为rno_circ₀004002/miR-342-5p/Wnt3a轴主要在肛门直肠发育后期起到调节作用,其中任何分子的表达或调控异常都可能促进ARM的进展。结论:1、CircRNA存在于大鼠胚胎的肛门直肠组织中,并且在ARM和正常胎鼠中具有差异表达的特性。2、Rno_circ₀004002与肛门直肠发育相关,rno_circ₀004002在肛门直肠组织中表达减少会促进ARM的进展;在IEC-6细胞中表达减少时通过促进凋亡、抑制增殖和EMT调控细胞功能。3、MiR-342-5p表达增多和Wnt3a表达减少会促进ARM的进展。Rno_circ₀004002可以作为miR-342-5p的分子海绵正向调控Wnt3a的表达,并通过rno_circ₀004002/miR-342-5p/Wnt3a轴调控细胞功能的改变。