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肾细胞癌简称肾癌（Renal cell carcinoma,RCC）,在肾脏恶性肿瘤中排名第一,在泌尿系所有恶性肿瘤中仅次于膀胱癌,位居第二,主要发生于肾小管上皮细胞,约占成年患者所有恶性肿瘤的2%-3%,该病发病机制复杂,而且病症隐秘性强,早期阶段并无明显症状,导致大多数患者在发病时已处于中晚期阶段,即使接受根治性手术切除的患者仍有20%-40%会逐渐出现复发或者转移,其对放疗、化疗并不敏感,因此迫切需要寻找新的治疗方法。近年来我们课题组一直利用条件增殖型腺病毒（Conditionally replicative adenovirus,CRAds）调控小干扰 RNA（smal l interfering RNA,siRNA）或其他治疗基因比如IL-18、IL-24等治疗泌尿系肿瘤,治疗效果令人振奋,但是距离完全消灭肿瘤还相差甚远,原因在于靶点不理想。LASP-1（LIM and SH3 protein 1）作为一种新发现的肌动蛋白结合蛋白,不仅可以参与细胞骨架的重新组合、调控和细胞迁移,而且和多种恶性肿瘤进展相关,参与肿瘤的增殖、侵袭和转移。然而该蛋白在人肾细胞癌中是否表达及其对肾癌进展有无影响尚未见报道。我们通过免疫组化和Western blot对肾癌组织和癌旁健康组织中LASP-1的表达水平进行对比分析,以探讨其在肾癌侵袭和迁移中有无作用。同时以LASP-1基因作为肾癌治疗靶点,通过构建荷载LASP-1基因siRNA的条件增殖型腺病毒,体内外观察其对肾癌的靶向治疗作用,为肾癌的治疗寻找新的靶点。第一部分 LASP-1在人肾癌中的表达和临床意义目的 探讨LASP-1在人肾癌中的表达,了解该蛋白在人肾癌进展中的作用。方法 通过蛋白印迹（WB）和免疫组化等方法检测切除的82例肾癌标本肿瘤组织和肿瘤旁组织中的LASP-1表达差异,了解LASP-1与肾肿瘤病理特征之间的联系。结果 免疫组织化学结果显示82例肾癌患者,肿瘤组织内LASP-1阳性者74例,阳性率为90.24%,肿瘤旁组织LASP-1阳性者22例,阳性率为26.83%,差异显著（P＜0.01）。LASP-1的表达和肿瘤有无淋巴结转移、TNM肿瘤分期和组织种类相关（P＜0.05）,和Furhman核分级及瘤体体积无关（P＞0.05）。Western blot检测发现,肿瘤旁组织LASP-1的表达量（0.818±0.064）和无淋巴结转移组LASP-1的表达量（1.443±0.154）明显低于有淋巴结转移组肿瘤组织的表达量（2.030±0.183）,差异有统计学意义（P＜0.05）结论 检测肾癌组织中LASP-1的表达可以了解肾肿瘤进展和评估预后。同时为肾癌的靶向治疗提供新的靶点。第二部分 条件增殖型腺病毒ZD55-LASP-1的构建及纯化目的 利用腺病毒包装质粒pBHGE3与携带LASP-1 siRNA的穿梭质粒pZD55-LASP-1、pCA13-LASP-1 在 HEK293 细胞内,包装成病毒 ZD55-LASP-1 和Ad-LASP-1。方法 细胞培养平皿铺满HEK293细胞。利用Effectene DNA转染试剂将包装质粒pBHGE3与穿梭质粒pZD55-LASP-1、pCA13-LASP-1分别感染HEK293细胞,待病毒空斑（1-2周）出现后,纯化并扩增病毒,抽提ZD55-LASP-1和Ad-LASP-1的DNA。操作流程依照说明书进行,获得条件增殖型腺病毒ZD55-LASP-1、复制缺陷型腺病毒Ad-LASP-1。通过PCR分别鉴定Ad-LASP-1、ZD55-LASP-1是否包含目的基因,E1区是否缺失及有无无野生型腺病毒污染。鉴定正确的病毒进行扩增,CsCl梯度离心法纯化,50%组织培养感染量（TCID50）法测病毒滴度。结果 酶切和聚合酶链式反应（PCR）鉴定证明ZD55-LASP-1未混杂野生型腺病毒,且包含目的序列LASP-1 siRNA;Ad-LASP-1的E1区缺失,且包含目的序列LASP-1 siRNA。表达LASP-1 siRNA序列的病毒ZD55-LASP-1证实重组成功。ZD55-LASP-1 病毒滴度为 4×1010 PFU/ml,Ad-LASP-1 病毒滴度为 2×1010PFU/ml。将Ad-LASP-1、ZD55-LASP-1进行扩增,利用氯化铯纯化病毒DNA,于-80℃冰箱内贮存。结论 靶向表达LASP-1 siRNA序列的病毒ZD55-LASP-1重组成功,为肾癌的下一步基因治疗提供了基础。第三部分 荷载LASP-1 siRNA的条件增殖型腺病毒抑制肾癌生长的体内外实验研究目的 体内外研究表达LASP-1 siRNA的条件增殖型腺病毒ZD55-LASP-1对肾细胞癌的影响,为肾癌的靶向基因治疗奠定基础。方法 细胞实验:Western Blot检测ZD55-LASP-1感染肿瘤细胞及正常细胞后E1A蛋白的表达,和对肾癌细胞LASP-1蛋白表达的影响;CCK8法研究ZD55-LASP-1对786-0细胞的增殖抑制作用。Transwell、Invasion研究ZD55-LASP-1对786-0细胞迁移和侵袭的抑制作用。细胞凋亡检测试剂盒（Annexin V-FITC/PI）检测ZD55-LASP-1对786-0细胞的凋亡作用。体内实验:构建裸鼠人肾癌786-0细胞移植瘤模型。随机分成4组,每组8只,移植瘤瘤体内分别注射磷酸缓冲盐溶液（PBS对照组）、复制缺陷型腺病毒Ad-LASP-1、条件增殖型腺病毒ZD55-EGFP（携带绿色荧光蛋白基因）和条件增殖型腺病毒ZD55-LASP-1各100ul（含病毒5×108PFU）,两天一次,共计三次,每七天测量移植瘤体积一次并绘制时间-体积生长曲线。7周后将所有动物处死,并进行如下检测:肿瘤细胞内LASP-1蛋白的表达量（免疫组织化学法）;移植瘤内腺病毒E1A基因的表达情况（免疫荧光法）;肾癌细胞的凋亡检测（原位末端标记技术TUNEL法）;取裸鼠肝脏和肺脏组织进行HE染色了解有无肝脏损害和有无远处肺转移。结果 1.Western Blot结果显示条件增殖型病毒ZD55-LASP-1和ZD55-EGFP E1A基因在786-0细胞中阳性表达,提示两种增殖病毒能够在786-0细胞中增殖。但两种病毒在非肿瘤细胞（肾皮质近曲小管上皮细胞,HK-2细胞）均未见表达E1A蛋白,提示新型增殖病毒ZD55-LASP-1具有肿瘤细胞内靶向增殖的特点。肿瘤细胞中靶蛋白LASP-1的表达量在ZD55-LASP-1组和ZD-EGFP组明显降低,分别为（0.417±0.052）,（0.753±0.026）,而对照组为（0.817±0.018）,ZD55-LASP-1 较对照组差异有统计学意义（P＜0.01）。证实ZD55-LASP-1可以有效地沉默肾癌细胞中LASP-1基因蛋白的表达。2.细胞增殖实验（CCK-8法）:786-0细胞的存活数量随病毒转染时间的延长而逐渐减少。病毒ZD55-LASP-1对786-0细胞的杀伤效果明显强于ZD55-EGFP组和对照组;转染96h后,各处理组肾癌细胞存活率分别为对照组（2.448±0.128）,ZD55-EGFP组（2.300±0.209）,ZD55-LASP-1 组仅为（1.388±0.095）,ZD55-LASP-1 组较 ZD55-EGFP和对照组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。3.侵袭实验:Transwell结果提示对照组穿过的肿瘤细胞数多达（80.167±5.113）,ZD55-EGFP组穿过的肿瘤细胞数为（79.333±4.459）,而ZD55-LASP-1组仅为（28.833±5.209）,表明ZD55-LASP-1可明显抑制肿瘤细胞的侵袭。迁移实验:Matrigel invasion结果显示对照组穿膜的肿瘤细胞数为（70.610±6.519）,ZD55-EGFP组穿模的肿瘤细胞数为（69.587±4.249）,ZD55-LASP-1组穿模的肿瘤细胞数较对照组显著减少,仅为（22.433±7.299）,其可明显抑制肿瘤细胞的迁移,差异显著（P＜0.01）。4.细胞凋亡实验:Annexin V-FITC/PI法对不同处理组肿瘤细胞进行凋亡检测,结果显示:对照组凋亡细胞数（8.724±0.745）%＜ZD55-EGFP（8.932±0.663）%＜ZD55-LASP-1（19.134±0.871）%,差异显著（P＜0.05）。5.LASP-1促进肾癌的侵袭与转移可能与EMT有关:为了探索LASP-1在肾癌的侵袭与转移中的机制,我们做了相关蛋白研究,发现当抑制LASP-1蛋白后,N-cadherin和Vimentin两种蛋白表达下降,而E-cadherin蛋白表达上升,由此猜测LASP-1可能通过EMT促进肾癌的进展。6.移植瘤体积:裸鼠移植瘤体内注射不同病毒后ZD55-LASP-1显著抑制肿瘤生长,7周后移植瘤平均体积:ZD55-LASP-1处理组355.4±47.4 mm3＜ZD55-EGFP处理组 541.2±56.1mm3＜AD-LASP-1 处理组 720.1±74.5 mm3＜对照组 1051.1±122.7mm3,ZD55-LASP-1肿瘤体积相对其他各组,差异有统计学意义（P＜0.05）。7.E1A蛋白检测:通过免疫荧光法检测各处理组E1A蛋白,对照组和非增殖病毒AD-LASP-1组无E1A蛋白阳性信号,但两种增殖型腺病毒ZD55-LASP-1和ZD55-EGFP组可发现E1A表达,后者说明病毒可以增殖。8.移植瘤组织中LASP-1的检测:通过免疫组化检测发现,ZD55-LASP-1处理组较ZD55-EGFP、AD-LASP-1和PBS组能够显著抑制靶基因LASP-1蛋白的表达。差异有统计学意义（P＜0.05）。9.不同处理组移植瘤细胞凋亡TUNEL实验结果:对照组（13.8±1.6%）＜AD-LASP-1 处理组（26.3±3.1%）＜ZD55-EGFP 处理组（34.9±3.2%）＜ZD55-LASP-1 处理组（45.9±4.6%）,ZD55-LASP-1较对照组差异有统计学意义（P＜0.05）。10.肿瘤组织HE染色:ZD55-LASP-1、ZD55-EGFP处理组发现病毒注射的部位肿瘤内出现坏死组织,三种病毒处理组均显示移植瘤组织生长受抑,显微镜下表现为染色较深,核仁不明显。对照组显微镜下可见细胞增殖明显,表现为核仁清晰,核内染色质疏松。11.裸鼠肺组织HE染色:ZD55-LASP-1和Ad-LASP-1处理组肺组织内未发现转移灶,但对照组和ZD55-EGFP处理组分别有3只和1只裸鼠出现肿瘤的远处肺转移,提示ZD55-LASP-1可通过沉默LASP-1基因而抑制肿瘤的远处转移。12.各处理组肝脏HE染色未示异常,提示病毒未导致肝脏毒性。结论:体内外实验证实荷载LASP-1基因siRNA的条件增殖型腺病毒ZD55-LASP-1,可在肾癌中靶向性复制并沉默靶基因LASP-1;通过沉默靶基因抑制肿瘤生长和侵袭,并促进肿瘤细胞的凋亡,为肾恶性肿瘤的基因靶向治疗提供了实验依据。