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目的:血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells,VSMCs）是构成血管壁的主要细胞类型之一,VSMCs异常增殖、自噬与心肌梗死、冠心病和心力衰竭等心血管疾病的发生发展密切相关。微小RNA（micro RNAs,miRNAs）是一类大小约22个核苷酸的内源性小分子RNA,越来越多的研究表明,miRNAs参与调控细胞增殖、自噬和分化等生理过程。环状RNA（circular RNAs,circ RNAs）具有共价闭合环状结构,不受核酸外切酶的降解,比线性非编码RNA更加稳定,在高血压、动脉粥样硬化、糖尿病等心血管疾病的发生发展中扮演重要角色。我们通过小RNA测序,筛选增殖型人主动脉血管平滑肌细胞（human aortic vascular smooth muscle cells,HASMCs）与静止型HASMCs中差异表达的小RNA,发现miR-154-5p在增殖型HASMCs表达水平显著下调;亚细胞定位分析发现,miR-154-5p在HASMCs细胞质和细胞核中均有分布。然而,其在HASMCs增殖和自噬中的作用尚不清楚,因此我们分别从miRNAs-m RNA和miRNAs-启动子角度,预测miR-154-5p潜在的靶基因并进行鉴定。另外,通过miRNAs-circ RNAs共表达分析发现,circ-154与miR-154-5p存在共表达关系,提示circ-154可能调控miR-154-5p的表达。本研究对miR-154-5p调控HASMCs增殖与自噬的分子机制和circ-154与miR-154-5p的调控关系进行论证,以期为探索HASMCs增殖和自噬的分子机制提供新途径。方法:1.通过qRT-PCR检测增殖型和静止型HASMCs中miR-154-5p的表达水平;检测增殖型HASMCs细胞核和细胞质中miR-154-5p的表达水平。2.miR-154-5p抑制HASMCs增殖从细胞核miRNAs靶向基因启动子调控转录的角度出发,我们使用RNAhybrid和Mi Randa筛选出miR-154-5p在细胞核中的靶基因PRKD2;从细胞质miRNAs靶向m RNA调控翻译的角度出发,联合运用miRTar Base、Target Scan和miRWalk筛选出miR-154-5p在细胞质中的靶基因HMGA2;PRKD2、HMGA2是细胞增殖相关的蛋白。将miR-154-5p mimics转染HASMCs,通过Western blot检测PRKD2、HMGA2和PCNA表达水平;通过CCK-8和Ed U检测其对HASMCs活力和增殖的影响。3.miR-154-5p抑制HASMCs自噬从细胞质miRNAs靶向m RNA调控翻译的角度出发,联合运用miRTar Base、Target Scan和miRWalk筛选出miR-154-5p在细胞质中的靶基因ATG7。将miR-154-5p mimics转染HASMCs,24 h后,用5μM雷帕霉素继续处理24 h,通过Western blot检测ATG7、LC3-II/I和p62表达水平。将miR-154-5p mimics与RFP-GFP-LC3质粒共转染HASMCs,24 h后,用5μM雷帕霉素继续处理24 h,通过激光共聚焦显微镜检测自噬流的变化情况。4.构建circ-154重组质粒,并通过qRT-PCR验证其过表达效率。将circ-154重组质粒或circ-154 si RNA转染HASMCs,通过qRT-PCR检测miR-154-5p的表达水平。5.circ-154抑制HASMCs增殖将circ-154重组质粒或circ-154 si RNA转染HASMCs,通过Western blot检测PRKD2、HMGA2和PCNA表达水平。将circ-154重组质粒转染HASMCs,通过CCK-8和Ed U检测其对HASMCs活力和增殖的影响。6.circ-154抑制HASMCs自噬将circ-154 si RNA转染HASMCs,通过Western blot检测ATG7、LC3-II/I和p62表达水平。将circ-154重组质粒转染HASMCs,24 h后,用5μM雷帕霉素继续处理24 h,通过Western blot检测ATG7、LC3-II/I和p62表达水平。将circ-154重组质粒与RFP-GFP-LC3质粒共转染HASMCs,24 h后,用5μM雷帕霉素继续处理24 h,通过激光共聚焦显微镜检测自噬流的变化情况。7.miR-154-5p结合ATG7 3′-UTR根据ATG7和miR-154-5p的结合位点,化学合成野生型（WT）和突变型（MT）序列,并在其5’端和3’端分别引入Xho I酶和Not I酶的粘性末端,插入psi CHECKTM-2 Vector,转化后挑取单个菌落,进行菌落PCR、单酶切鉴定和测序分析。进行双荧光素酶报告基因实验,验证ATG7是否为miR-154-5p的直接靶基因。结果:1.miR-154-5p在增殖型HASMCs中下调,miR-154-5p在增殖型HASMCs的细胞核和细胞质中均有分布,且细胞核中表达较高。2.在HASMCs中,miR-154-5p抑制PRKD2、HMGA2和PCNA蛋白表达;CCK-8和Ed U结果表明miR-154-5p抑制HASMCs活力和增殖。3.在HASMCs中,miR-154-5p抑制ATG7和LC3-II/I蛋白表达,促进p62蛋白表达;LC3自噬双荧光检测表明miR-154-5p抑制HASMCs自噬。4.成功构建circ-154重组质粒;在HASMCs中,circ-154上调miR-154-5p的表达,而circ-154 si RNA下调miR-154-5p的表达。5.在HASMCs中,circ-154上调PRKD2、HMGA2和PCNA蛋白表达,而circ-154 si RNA下调PRKD2、HMGA2和PCNA蛋白表达;CCK-8和Ed U结果表明circ-154抑制HASMCs活力和增殖。6.在HASMCs中,circ-154下调ATG7、LC3-II/I蛋白表达,上调p62蛋白表达,而circ-154 si RNA上调ATG7、LC3-II/I蛋白表达,下调p62蛋白表达;LC3自噬双荧光检测表明miR-154-5p抑制HASMCs自噬。7.经菌落PCR、单酶切鉴定和测序分析共同证实ATG7-WT和ATG7-MT报告基因质粒成功构建,双荧光素酶报告基因结果表明,ATG7是miR-154-5p的直接靶基因。结论:1.miR-154-5p靶向调控HMGA2和ATG7,抑制HASMC增殖与自噬。2.circ-154上调miR-154-5p抑制HASMCs增殖与自噬。