聚羟基丁酸酯(PHB)产生菌的选育

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聚-3-β-羟基丁酸酯(Poly-3-β-yhydroxybutyrate,简称PHB)是大部分微生物能够合成的一种胞内高聚酯。外观是白色粉末,无味,易溶于氯代烃、异丙醇等溶剂,不溶于水、丙酮、乙醇、甲醇等,是一种重要的化工产品,在医疗器械、塑料加工、精细化工、工农生产等领域应用广泛。随着石化能源危机的到来,生活环境的日益破坏,人们对生活品质的不断提高,传统石油基塑料渐渐显露出它的缺点,而作为绿色环境友好型塑料重要代表之一的PHB,具有良好的生物相容性,生物可降解性以及类塑性质,经过不同制造工艺和加工手段,可以生产出利用价值高且完全绿色环保的塑料制品。本文主要探究了从田间土壤、工厂污泥、油田污泥三种样品中筛选出产PHB的野生菌株ym-1并对其进行常压室温等离子体(ARTP)诱变以及紫外线诱变,考察了复合诱变株YM-1的传代稳定性,并进行了ym-1野生株与YM-1复合诱变株的形态与产量对比。结果显示,ARTP诱变时间为180s,紫外诱变时间为90s;筛选出高产PHB复合诱变株为YM-1,其菌落形态较野生株大且厚,菌体粗壮且经尼罗蓝染色后荧光强度增加;摇瓶发酵72h,YM-1复合诱变株较ym-1野生株菌体量增加了约44.69%,PHB产量增加了约55.37%。研究了PHB荧光分光光度检测的方法,考察了荧光分光光度检测法的条件和不同EDTA浓度对检测结果的影响,同时绘制PHB荧光分光光度检测法的标准曲线,建立了荧光分光光度检测PHB含量的改良方法,对改良方法进行了加标回收实验和精确度实验以及不同PHB检测方法比对实验。结果显示,改良的荧光分光光度检测法设置检测条件为激发波长为365nm,发射波长为647nm,增益8档,扫描速度为1000nm/min,EDTA浓度为0.02g/L;以PHB质量浓度(C)为横坐标、荧光强度(F)为纵坐标进行线性回归得回归方程为F=521.27C+40.7795(R2=0.99094),PHB质量浓度在0.0125~0.1625mg/mL;加标回收实验的平均加标回收率为98.29%,RSD=0.986%(n=9);精确度实验RSD=0.406%(n=5)。对YM-1复合诱变株进行摇瓶发酵研究,确定了YM-1复合诱变株发酵生产PHB的最佳碳源为1%葡萄糖,最佳氮源为0.05%(NH4)2SO4,最佳pH为7.5。对YM-1复合诱变株进行了5L发酵罐发酵,YM-1复合诱变株发酵生产PHB的最终产量为33.56mg/mL,菌体量49.78mg/mL,PHB含量为67.42%。
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