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稻瘟病是影响水稻生产可持续发展的最严重的病害之一，对世界粮食安全构成了严重的威胁。为了避免化学农药过度使用造成的环境问题，生物防治，尤其是以植物内生菌资源来控制病害，有效且绿色安全，受到了研究者的广泛关注。
本论文以实验室前期分离筛选出的一株具有拮抗稻瘟病菌潜力的水稻内生放线菌StreptomyceshygcrscopicusOsiSh-2为研究对象，评价其田间防治效果，探究OsiSh-2与稻瘟病菌之间的作用模式，并分离其活性代谢产物，为阐明内生放线菌的拮抗机制，及开发稻瘟病生防制剂提供理论基础。相关的研究内容和结果如下：
1.田间实验确证了OsiSh-2处理的水稻表现出良好的抗稻瘟病及促生效果：大田条件下，浓度为107spores/mL的孢子液喷施水稻叶面后，苗瘟和穗瘟的病情指数显著降低，防治效率分别最高分别可达59.67%和61.31%。同时，在发病状态下，经OsiSh-2处理的水稻展现出了明显的促生增产效果，苗期水稻的高度增加达60.0%，并减少了成熟期水稻因稻瘟病引起的产量损失达56.58%。对水稻内定殖的OsiSh-2重分离结果发现，防治效率高的水稻叶片中OsiSh-2分离率也对应最高，说明OsiSh-2的生防效果与其定殖数量有关。以上结果均表明OiSh-2有作为生物农药和肥料开发的潜力。
2.系统研究了OsiSh-2活性产物抑制稻瘟病菌的作用模式：体外拮抗实验表明，5%的OsiSh-2发酵滤液对稻瘟病菌MagnaportheoryzaeGUY11的抑菌活性就达64.22%，同时10%发酵滤液对苹果树腐烂病菌和玉米小斑病菌等25种植物病原真菌表现出广谱的抗菌效果，抑菌率从56.4%至100%不等。OsiSh-2发酵滤液的稳定性实验表明，其有效成分在温和pH及100℃以下表现稳定，但对光照较敏感。OsiSh-2发酵滤液能强烈抑制稻瘟病菌菌丝生长、分生孢子萌发和附着胞形成，并使菌丝出现皱缩、聚集等畸形和细胞质严重泄露等现象。进一步检测发现，OsiSh-2发酵滤液使稻瘟病菌细胞壁几丁质异常沉积，真菌细胞壁完整性通路上的相关基因被激活，表明真菌细胞壁受到攻击。同时，稻瘟病菌细胞膜麦角固醇含量减少，细胞内容物外泄，三羧酸循环中柠檬酸合酶、琥珀酸脱氢酶等酶活受到影响，活性氧大量积累。这些结果说明，OsiSh-2通过直接破坏真菌细胞壁和细胞膜的完整性，影响线粒体功能，最终导致稻瘟病菌的抑制和死亡。
3.测定了OsiSh-2的全基因组序列并进行了生物信息学分析：OsiSh-2全基因组大小为10,242,506bp，GC含量为72.06%，具有蛋白质编码功能的基因有7,908个，tRNA编码基因64个，核糖体RNA操纵子3个。对其基因组中次级代谢产物合成基因簇进行预测和分析，显示OsiSh-2的基因组中有75个能编码多种次级代谢产物合成基因簇，包括33个PKSⅠ型基因簇，7个NRPS型基因簇，3个PKS-NRPS杂合型基因簇，2个NRPS杂合型基因簇。其基因簇数量及种类均优于大部分文献报道的天然产物生产放线菌以及植物内生放线菌。以上分析表明OsiSh-2具有合成多种次级代谢产物的能力，有可能分泌多种活性物质来抑制稻瘟病菌生长。
4.对OsiSh-2所产生的部分活性产物进行了分离鉴定：通过平板检测发现OsiSh-2能分泌几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶等真菌细胞壁降解酶。且稻瘟病菌粗毒素能加快OsiSh-2初始生长速度，提前和延长稳定期，并诱导其真菌细胞壁水解酶活增加，抗菌能力提高。对OsiSh-2发酵液进行定量检测发现，OsiSh-2能产生生长素、细胞分裂素和赤霉素等植物激素，可能以此来促进植物生长，提高植物的抗病性。OsiSh-2的甲醇和正丁醇萃取液对稻瘟病菌拮抗效果最强，抑菌率分别达到62.86%和55.34%，表明其抗菌物质为极性较大的化合物。结合生物信息学分析及LC/MS检测证实了OsiSh-2产尼日利亚菌素，该物质对稻瘟病菌有一定的抑制效果。除此之外，OsiSh-2还可能产生丰加霉素、jerangolid、halstoctacosanolide和micromonolactam等抗生素。进一步对OsiSh-2进行了500L大规模发酵，发酵液经大孔树脂吸附、乙醇梯度洗脱，结合硅胶柱层析、凝胶柱层析、半制备高效液相等分离技术分离到了具有抗稻瘟病菌活性的13种化合物，经过核磁共振解析得到了1-acetyl-β-carboline和邻苯二甲酸二丁酯等5种化合物的结构。这些结果均表明，OsiSh-2有可能通过分泌真菌细胞壁降解酶、小分子抗生素以及产生植物激素来达到生物防治稻瘟病的目的。
总之，本研究证实了OsiSh-2具有很好的促进水稻抗稻瘟病和植物生长的能力，阐明了OsiSh-2活性产物高效拮抗稻瘟病菌的分子作用机制并对其代谢产物进行了分析和初步鉴定。本研究为最终阐明现有的水稻内生放线菌抗病机理提供了充分的科学依据，具有重要的科学价值，为OsiSh-2应用于生物防治稻瘟病奠定了理论基础。
本论文以实验室前期分离筛选出的一株具有拮抗稻瘟病菌潜力的水稻内生放线菌StreptomyceshygcrscopicusOsiSh-2为研究对象，评价其田间防治效果，探究OsiSh-2与稻瘟病菌之间的作用模式，并分离其活性代谢产物，为阐明内生放线菌的拮抗机制，及开发稻瘟病生防制剂提供理论基础。相关的研究内容和结果如下：
1.田间实验确证了OsiSh-2处理的水稻表现出良好的抗稻瘟病及促生效果：大田条件下，浓度为107spores/mL的孢子液喷施水稻叶面后，苗瘟和穗瘟的病情指数显著降低，防治效率分别最高分别可达59.67%和61.31%。同时，在发病状态下，经OsiSh-2处理的水稻展现出了明显的促生增产效果，苗期水稻的高度增加达60.0%，并减少了成熟期水稻因稻瘟病引起的产量损失达56.58%。对水稻内定殖的OsiSh-2重分离结果发现，防治效率高的水稻叶片中OsiSh-2分离率也对应最高，说明OsiSh-2的生防效果与其定殖数量有关。以上结果均表明OiSh-2有作为生物农药和肥料开发的潜力。
2.系统研究了OsiSh-2活性产物抑制稻瘟病菌的作用模式：体外拮抗实验表明，5%的OsiSh-2发酵滤液对稻瘟病菌MagnaportheoryzaeGUY11的抑菌活性就达64.22%，同时10%发酵滤液对苹果树腐烂病菌和玉米小斑病菌等25种植物病原真菌表现出广谱的抗菌效果，抑菌率从56.4%至100%不等。OsiSh-2发酵滤液的稳定性实验表明，其有效成分在温和pH及100℃以下表现稳定，但对光照较敏感。OsiSh-2发酵滤液能强烈抑制稻瘟病菌菌丝生长、分生孢子萌发和附着胞形成，并使菌丝出现皱缩、聚集等畸形和细胞质严重泄露等现象。进一步检测发现，OsiSh-2发酵滤液使稻瘟病菌细胞壁几丁质异常沉积，真菌细胞壁完整性通路上的相关基因被激活，表明真菌细胞壁受到攻击。同时，稻瘟病菌细胞膜麦角固醇含量减少，细胞内容物外泄，三羧酸循环中柠檬酸合酶、琥珀酸脱氢酶等酶活受到影响，活性氧大量积累。这些结果说明，OsiSh-2通过直接破坏真菌细胞壁和细胞膜的完整性，影响线粒体功能，最终导致稻瘟病菌的抑制和死亡。
3.测定了OsiSh-2的全基因组序列并进行了生物信息学分析：OsiSh-2全基因组大小为10,242,506bp，GC含量为72.06%，具有蛋白质编码功能的基因有7,908个，tRNA编码基因64个，核糖体RNA操纵子3个。对其基因组中次级代谢产物合成基因簇进行预测和分析，显示OsiSh-2的基因组中有75个能编码多种次级代谢产物合成基因簇，包括33个PKSⅠ型基因簇，7个NRPS型基因簇，3个PKS-NRPS杂合型基因簇，2个NRPS杂合型基因簇。其基因簇数量及种类均优于大部分文献报道的天然产物生产放线菌以及植物内生放线菌。以上分析表明OsiSh-2具有合成多种次级代谢产物的能力，有可能分泌多种活性物质来抑制稻瘟病菌生长。
4.对OsiSh-2所产生的部分活性产物进行了分离鉴定：通过平板检测发现OsiSh-2能分泌几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶等真菌细胞壁降解酶。且稻瘟病菌粗毒素能加快OsiSh-2初始生长速度，提前和延长稳定期，并诱导其真菌细胞壁水解酶活增加，抗菌能力提高。对OsiSh-2发酵液进行定量检测发现，OsiSh-2能产生生长素、细胞分裂素和赤霉素等植物激素，可能以此来促进植物生长，提高植物的抗病性。OsiSh-2的甲醇和正丁醇萃取液对稻瘟病菌拮抗效果最强，抑菌率分别达到62.86%和55.34%，表明其抗菌物质为极性较大的化合物。结合生物信息学分析及LC/MS检测证实了OsiSh-2产尼日利亚菌素，该物质对稻瘟病菌有一定的抑制效果。除此之外，OsiSh-2还可能产生丰加霉素、jerangolid、halstoctacosanolide和micromonolactam等抗生素。进一步对OsiSh-2进行了500L大规模发酵，发酵液经大孔树脂吸附、乙醇梯度洗脱，结合硅胶柱层析、凝胶柱层析、半制备高效液相等分离技术分离到了具有抗稻瘟病菌活性的13种化合物，经过核磁共振解析得到了1-acetyl-β-carboline和邻苯二甲酸二丁酯等5种化合物的结构。这些结果均表明，OsiSh-2有可能通过分泌真菌细胞壁降解酶、小分子抗生素以及产生植物激素来达到生物防治稻瘟病的目的。
总之，本研究证实了OsiSh-2具有很好的促进水稻抗稻瘟病和植物生长的能力，阐明了OsiSh-2活性产物高效拮抗稻瘟病菌的分子作用机制并对其代谢产物进行了分析和初步鉴定。本研究为最终阐明现有的水稻内生放线菌抗病机理提供了充分的科学依据，具有重要的科学价值，为OsiSh-2应用于生物防治稻瘟病奠定了理论基础。