研究背景心肌梗死(Myocardial infarction, MI)是由于冠状动脉循环改变引起冠状血流和心肌需求之间不平衡而导致的心肌损害,是临床上一种严重的缺血性心脏病(Ischemic heart disease, IHD)。目前,治疗冠心病的常用方法诸如药物、经皮冠状动脉腔内成形术及冠状动脉旁路移植等虽然能改善心肌缺血,却不能使梗死区的血管再生。新近国内外兴起的一些干细胞移植实验治疗缺血性心脏病,通过再生血管,为治疗这类疾病提供了新思路。干细胞移植治疗心肌梗死在大量动物实验及临床中的应用已取得了令人鼓舞的疗效,越来越多的证据表明,骨髓来源的干细胞能够参与血管新生,改善心肌梗死后血流灌注及心脏功能。被用于移植的细胞种类很多,其中骨髓间充质干细胞(Mesenchymal stem cells, MSCs)目前被公认最适合用于细胞移植治疗,其易于分离提取,具有高度的扩增潜能,有良好的基因稳定性、组织相容性好、不涉及伦理道德问题等优点,成为研究的热点。但干细胞移植治疗心肌缺血目前还存在一些问题,包括干细胞移植途径的有创性、细胞移植效率低下及干细胞的定向归巢能力欠佳等。如何寻找一种无创、移植效率更高及定向能力好的移植途径与方法呢?研究显示,脉冲式治疗超声联合白蛋白微泡Optison能有效将经静脉移植的骨髓单个核细胞靶向运送至心肌病动物模型,心肌毛细血管密度、缺血心肌的血流灌注,VCAM-1,ICAM-1等黏附分子表达均得到了显著提高,心脏功能也得到明显改善,表明超声介导的微泡破坏能提高干细胞的靶向归巢能力进而更有效地实现干细胞移植治疗心脏病的效果。研究目的1.探讨诊断超声联合微泡促进静脉移植骨髓MSCs归巢兔缺血心肌的可行性及其机制;2.探讨诊断超声联合微泡静脉移植MSCs改善梗死后心肌血流灌注和心功能的有效性;3.初步探讨诊断超声联合微泡作用下无创移植MSCs改善心肌梗死后心功能的可能机制。研究方法采用密度梯度离心联合贴壁培养法进行兔骨髓MSCs的分离、纯化及培养,检测其生物学特性。流式细胞仪检测细胞表面标记分子,成脂、成骨诱导分化进行细胞鉴定。冠状动脉左前降支结扎法建立兔心肌梗死模型,采用血清学、影像学及病理学方法评价模型的建立。以荧光标记物DAPI标记MSCs,移植48h观察标记MSCs在静脉移植MSCs组与超声+微泡+MSCs组心肌、肺等脏器的荧光分布并进行阳性细胞计数和统计学比较。MSCs移植后4周透射电镜观察各组(PBS组、超声+微泡组、静脉移植MSCs组与超声+微泡+MSCs组)心肌缺血区血管超微结构。免疫组织化学检测心肌缺血区VCAM-1、SDF-1表达并行定量分析。MSCs移植后4周HE染色检测心肌缺血区的血管密度(Capillary density,CD)、免疫组织化学检测CD34表达、western blot检测血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)水平,心肌声学造影(Myocardial contrast echocardiography, MCE)评价心肌血流灌注。Masson染色检测心肌胶原纤维形成,并计算各组胶原面积。免疫组织化学检测各组心肌梗死区Bax蛋白的表达情况。通过M型超声与双平面Simpson法检测左室收缩功能。结果培养的MSCs贴壁生长,呈梭形为主;细胞表面高表达CD44,几乎不表达CD45,不表达CD34。成脂诱导培养后油红O染色胞浆脂滴形成,成骨诱导后碱性磷酸酶染色见钙颗粒,茜素红S染色钙结节形成。冠状动脉结扎法建立MI模型后,MCE显示左室前壁、前间隔呈灌注缺损,Masson染色左室前壁梗死区呈蓝色染色。心肌梗死后兔左室收缩功能明显降低。荧光显微镜下计数并比较静脉移植MSCs组与超声+微泡+MSCs组心肌梗死及周围区DAPI阳性细胞数,分别为(147±19)个,(213±27)个,差异有统计学意义(P<0.01)。在正常供血区心肌内未见阳性细胞。透射电镜显示超声+微泡+MSCs组与超声+微泡组心肌缺血区血管一侧内皮细胞间隔增大,血管通透性增加。免疫组织化学检测SDF-1在各组中的心肌细胞胞膜与胞浆均有棕黄色阳性表达,超声+微泡+MSCs组的灰度(188.45±2.83)与静脉移植MSCs组(183.94±7.29)间差异无统计学意义(P>0.05),高于超声+微泡组(175.46±8.13)和PBS组(170.52±6.04)(两者P<0.05)。超声+微泡+MSCs组的VCAM-1阳性细胞数量(77±44)个显著高于静脉移植MSCs组(34±18)个,超声+微泡组(12±3)个及PBS组(8±5)个(三者P<0.01)。HE染色检测超声+微泡+MSCs组平均CD为(44±23)个,高于PBS组(19±10)个、超声+微泡组(22±5)个及MSCs组(26±7)(三者P<0.01)。Masson染色检测心肌胶原面积分别为PBS组(16.88±5.84)%、超声+微泡组(14.77±2.95)%、MSCs组(12.05±4.83)%和超声+微泡+MSCs组(8.97±3.5)%,超声+微泡+MSCs组与前三组比较,胶原面积分别缩小约25.6%、40.1%及46.8%。免疫组织化学检测超声+微泡+MSCs组CD34阳性血管最多,分布密集,MSCs组较丰富,超声+微泡组次之,PBS组的阳性血管最少。Bax蛋白阳性表达在PBS组最高,超声+微泡组次之,MSCs组进一步减少,超声+微泡+MSCs组最少。M型超声检测超声+微泡+MSCs组的FS(%)测值显著高于PBS组和超声+微泡组比较, P<0.01,高于静脉移植MSCs组,P<0.05。EF(%)比较,超声+微泡+MSCs组较PBS组及超声+微泡组显著增高(P<0.01),与静脉移植MSCs组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。双平面Simpson法EF值超声+微泡+MSCs组高于PBS组(P<0.01)、超声+微泡组(P<0.01)及静脉移植MSCs组(P<0.05)。结论1.成功实现兔骨髓源性MSCs的分离、纯化及培养,密度梯度离心联合贴壁培养法是获取、纯化、扩增MSCs简便、易行的方法。细胞生长曲线、细胞周期、透射电镜检测提示培养的MSCs呈低分化状态,有较强的自我更新能力。流式细胞仪检测培养细胞高表达CD44,CD45呈阴性表达,免疫细胞化学检测CD34阴性,体外成脂、成骨诱导分化成功,判定所获细胞为MSCs。2.冠状动脉左前降支结扎法可建立稳定的兔MI模型,血清学、影像学及病理学检测可有效评价模型是否成功建立。3. DAPI作为一种荧光剂,可有效示踪MSCs在体内各脏器、各部位的分布,其方法简单、操作简便,可应用于干细胞的标记。4.诊断超声联合脂膜微泡通过声孔效应可增加心肌梗死兔心肌血管通透性,为经静脉移植的MSCs归巢到达缺血心肌提供了更多的通道与机会。微泡介导的超声空化效应可刺激超声辐照心肌缺血区小血管破裂及炎症发生,促进局部VCAM-1等黏附分子的表达,进而增强移植的MSCs向心肌缺血区聚集与归巢;同时,诊断超声介导的微泡破坏效应通过促进VEGF生成与表达、刺激心肌缺血区血管生成等途径能更加有效改善心肌梗死后血流灌注。5. MSCs移植后通过旁分泌效应促进血管生成因子VEGF、归巢相关因子SDF-1、黏附分子VCAM-1的表达及抑制凋亡相关因子Bax表达,进而有效增强MSCs的趋化、黏附、聚集及归巢能力,通过促进血管新生及抑制凋亡等机制来改善心肌梗死后心功能。6.静脉移植MSCs在超声联合微泡介导下通过抑制心肌梗死后胶原纤维形成,抑制心脏重构来改善心功能。7.本研究方法以无创、有效促进MSCs定向归巢及改善心肌梗死后心功能在干细胞治疗心肌梗死中显示出较好的应用前景,有望为干细胞移植治疗冠心病提供一种新方法。