研究背景与目的妊娠期糖尿病(Gestational diabetes mellitus,GDM)是一种常见的妊娠期疾病,它指妊娠前糖代谢正常或有潜在糖耐量减退,妊娠期才出现或发现的糖尿病,我国发生率1%-5%,近年有明显增高趋势。近年来,越来越多的流行病学研究发现,暴露于妊娠糖尿病母亲宫内高血糖环境的子代罹患肥胖、糖耐量异常、II型糖尿病、心血管并发症的风险增加,从而形成了一个糖尿病产生糖尿病、肥胖等代谢性疾病的恶性循环。然而妊娠糖尿病子代对上述疾病易感的具体作用机制尚不清楚。目前认为,生命发育早期的不良影响因素(如宫内环境),通过对相关基因的表观遗传学修饰影响其基因表达,从而影响个体出生后对某些疾病的易感性。脂代谢是机体一种重要的物质代谢形式。肝脏与脂肪组织是机体合成脂肪的主要场所,而脂肪组织是机体储存脂肪的主要部位。从食物中消化入血的脂肪酸与甘油磷酸进入肝细胞或脂肪细胞,重新合成甘油三酯,并在脂肪细胞储存起来。脂肪组织中的甘油三酯经动员后分解为磷酸甘油与脂肪酸,后者是心肌、骨骼肌运动所需能量的主要来源。脂肪代谢异常与多种疾病的发生密切相关。脂代谢异常可导致高脂蛋白血症,引起冠心病及动脉粥样硬化。脂肪代谢异常也可引起肥胖症、呼吸系统疾病及肾衰等。同时脂肪代谢异常也可间接引起机体出现糖耐量异常乃至糖尿病的发生。PPIA(脯氨酰顺反异构酶A,Peptidyl-prolyl cis/trans isomerase A)是一种肽基辅氨酰顺反异构酶,具有广泛的生物学功能,以往研究表明PPIA参与了许多人类慢性疾病病理学的关键进程。例如,在病毒感染、心血管疾病和癌症等多种疾病中扮演重要作用。最近研究发现,在II型糖尿病病人的血清中PPIA明显升高,此外,3T3L1细胞向脂肪细胞分化过程中PPIA分泌增加,给宫内生长受限小猪喂养高蛋白饮食,引起PPIA在脂肪组织中的表达以及脂肪细胞的大小增加。这些研究提示,PPIA可能与肥胖和II型糖尿病的发生有关,但PPIA在肥胖发生中的具体作用及相关机制,目前尚无报道。鉴于妊娠糖尿病子代有罹患肥胖、糖尿病、心血管并发症等代谢性疾病的风险,而这些疾病与脂肪代谢均有着直接或间接的关系,因此我们推测妊娠期母体高血糖可能通过影响子代脂肪代谢从而导致子代对上述疾病的易感。本研究中,我们在大鼠妊娠糖尿病模型基础上观察了妊娠糖尿病对子代脂代谢的影响,并对其相关机制特别是PPIA在成脂中的作用及其相关分子机制作了进一步的深入探索。本研究主要的实验内容1.妊娠糖尿病影响了子代脂代谢。运用腹腔注射链脲霉素(Streptozotocin STZ)的方法构建大鼠妊娠糖尿病模型,在此基础上我们观察了仔鼠的脂肪体重比,检测了血脂的差异。结果显示:3周龄妊娠糖尿病仔鼠的脂肪体重比以及血浆甘油三脂、游离脂肪酸和低密度胆固醇含量均显著高于对照组仔鼠。上述结果提示妊娠糖尿病子代的脂代谢发生了改变。2.妊娠糖尿病改变了子代脂代谢相关基因的表达。运用荧光定量PCR方法检测3周龄仔鼠脂肪组织、肝脏、心肌及骨骼肌中脂代谢相关基因的表达,观察妊娠糖尿病子代脂代谢相关基因的表达情况。结果显示,妊娠糖尿病子代脂肪组织中PPIA、Slc27a1、Retn、FABP4、IRS3基因表达显著升高,IRS1基因表达显著降低。妊娠糖尿病子代肝脏组织中Slc27a1、CD36、FABP1、IRS2基因表达显著降低。妊娠糖尿病子代骨骼肌组织中CD36、Slc27a1、IRS1、IRS2、IRS3基因表达均显著降低,FABP3基因表达在雌性子代中显著降低。妊娠糖尿病子代心肌组织中CD36、Slc27a1、FABP3、IRS1、IRS2、IRS3均显著降低。结果表明妊娠糖尿病改变了子代脂代谢相关基因的表达。特别是与脂肪酸转运相关的基因在脂肪组织表达显著升高,而在利用脂肪酸的组织如肝脏、心肌、骨骼肌的表达却显著下降,提示妊娠糖尿病可能通过影响脂肪酸的转运功能从而引起子代脂代谢紊乱。肥胖相关基因PPIA的表达在脂肪组织中显著升高,可能的相关机制目前尚无报道。3.妊娠糖尿病子代脂肪组织中PPIA表达升高的表观遗传学机制。为探讨妊娠糖尿病子代脂肪组织中PPIA基因表达升高的可能机制,我们通过http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hg Gateway网站对PPIA基因进行在线分析,发现PPIA基因启动子区存在一个Cp G岛。进而我们运用BSP方法观察脂肪组织中PPIA基因启动子区Cp G岛的甲基化状态是否发生改变。结果显示该Cp G岛上的大部分Cp G位点处于去甲基化状态,在正常组有两处Cp G位点出现了明显的甲基化(p<0.05),而在妊娠糖尿病组没有出现甲基化。上述结果提示妊娠糖尿病子代脂肪组织中PPIA基因的表达升高可能与PPIA启动子区一些位点的去甲基化相关。但肥胖相关基因PPIA否参与了脂肪代谢以及相关分子机制如何值得我们进一步研究。4.PPIA在脂代谢中的作用及相关分子机制为了探讨PPIA对脂肪细胞分化的影响及其分子机制。首先在体外实验中,我们运用稳定干扰RNA方法将前体脂肪细胞3T3L1中内源性的PPIA沉默,结果发现PPIA沉默后可明显削弱3T3L1细胞的成脂分化能力。PPIA抑制剂Cs A同样阻滞了3T3L1细胞向脂肪细胞的分化。培养基中加入PPIA抗体对3T3L1细胞向脂肪细胞的分化没有明显抑制作用,这表明是细胞内的PPIA而不是分泌的PPIA对脂肪分化起着重要作用。进一步运用定量PCR方法检测了PPIA沉默后脂肪形成因子PPARG、C/EBPA及C/EBPB的表达,结果显示在3T3L1细胞成脂分化过程中,PPIA沉默同样明显抑制了PPARG、C/EBPA及C/EBPB的表达。这些结果提示,PPIA对小鼠3T3L1的成脂分化有重要促进作用,可能通过调节成脂因子如C/EBPB的表达来调控脂肪细胞分化。为进一步证实PPIA在体外对成脂的作用及分子机制,我们通过分离培养PPIA-/-和PPIA+/+小鼠的胚胎纤维母细胞(MEFs)并诱导成脂,观察其脂肪分化能力和脂肪形成因子表达情况。结果显示PPIA-/-MEFs与PPIA+/+MEFs相比脂肪分化能力明显受损。PPIA敲除后PPARG,C/EBPA和C/EBPB的表达明显受到抑制。并且进一步发现通过逆转录病毒感染PPIA-/-MEFs过表达外源PPIA后可明显恢复PPIA-/-MEFs脂肪分化能力。结果提示PPIA有促进小鼠MEFs成脂分化的作用。以上结果证明PPIA在体外有促进脂肪分化的作用,其可能的分子机制是通过调节成脂因子如C/EBPB的表达来调控脂肪细胞的分化。为了阐明PPIA在体内脂肪发育中的作用,我们利用PPIA基因敲除小鼠,通过比较PPIA KO小鼠与PPIA杂合子及野生型小鼠腹股沟及生殖腺脂肪量,以及利用计算机断层扫描对脂肪组织三维重构,观察PPIA KO小鼠脂肪量和脂肪分布的变化。并且运用免疫组化的方法进一步观察PPIA KO小鼠脂肪细胞的大小。结果显示,PPIA KO小鼠的腹股沟及生殖腺脂肪量均显著少于PPIA杂合子及野生型小鼠,并且PPIA缺失型小鼠的皮下脂肪,内脏脂肪以及总脂肪均少于野生型小鼠,其脂肪细胞也明显小于PPIA野生型小鼠。结果提示PPIA基因可能对小鼠脂肪细胞的发育有调节作用。为了进一步证实PPIA在体内对脂肪代谢的作用及其分子机制。我们通过高脂饮食诱导肥胖的方法,观察给予高脂饮食喂养后PPIA-/-小鼠和野生型小鼠体重的变化。定量PCR方法检测高脂饮食喂养后腹股沟脂肪组织中脂肪形成因子的表达情况。结果显示给予8周高脂饮食后PPIA-/-小鼠体重增加显著少于野生型小鼠。高脂饮食4周后,PPIA-/-小鼠脂肪组织中PPARG、C/EBPA、和C/EBPB的表达也明显低于野生型小鼠。这些结果提示小鼠中PPIA的缺乏能够抵抗高脂饮食诱导的肥胖,并进一步证实在体内PPIA同样有促进成脂的作用,其可能的分子机制与体外实验相同,都是通过调节成脂因子的表达来调控脂肪细胞的分化。综上所述,本研究在构建的大鼠妊娠糖尿病模型的基础上证实了妊娠糖尿病对子代脂代谢产生了重要影响,并发现一些已知的脂代谢相关基因的表达在子代中发生了显著改变。同时我们发现妊娠糖尿病子代脂肪组织中PPIA表达升高可能与PPIA启动子区某些位点的去甲基化相关。本研究中,我们首次证实了PPIA是一种新的促进脂肪形成因子,其可能通过调节PPARG、C/EBPA、C/EBPB等成脂因子的表达来调控脂肪细胞的分化。本研究不仅深化了对妊娠糖尿病宫内高糖环境对子代脂代谢的影响及其可能机制的认识,而且提示PPIA可能是治疗肥胖的新靶点。