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第一部分:不同类型的卵巢上皮性肿瘤和正常卵巢组织PPA1的表达目的:明确焦磷酸酶1(PPA1)在上皮性卵巢癌(EOC)、交界性肿瘤、卵巢良性上皮性肿瘤及正常卵巢组织中的表达差异,探讨PPA1表达和与EOC的发生发展及预后的关系。方法:1.应用免疫组化法检测PPA1蛋白在55例EOC、20例交界性卵巢肿瘤、24例卵巢良性上皮性肿瘤和23例人正常卵巢石蜡组织中的表达情况;分析EOC患者PPA1的表达水平与其临床病理参数的关系;对55例EOC患者进行随汸,分析其五年生存率和PPA1蛋白表达的关系。2.Real-time PCR和Western blot法检测人新鲜EOC组织和正常卵巢组织PPA1 m RNA及蛋白的表达水平。结果:1、免疫组化检测显示,PPA1在正常卵巢和良性卵巢肿瘤组织中低表达,而在卵巢交界性上皮肿瘤和EOC中高表达,并呈逐渐增加的趋势。2、EOC的组织学类型及患者年龄不同,PPA1的表达无显著差异。而EOC的不同临床分期和病理分级各组间,PPA1的表达有显著差异,PPA1的表达与临床分期和病理分级相关,并随临床分期和病理分级升高而呈升高趋势。与PPA1低表达的患者比较,PPA1表达高的患者五年生存率明显降低。3、人新鲜EOC肿瘤组织的PPA1蛋白及RNA表达均显著高于正常卵巢组织。结论:1.PPA1的表达与人EOC的分级和分期相关。可能在EOC的发生和进展中起重要作用。2.PPA1的表达高低对EOC的预后有一定的预测价值。第二部分:用RNA干扰的方法建立PPA1基因敲除的细胞系目的:建立PPA1基因敲除的稳定转染的EOC细胞系,用于进一步研究。方法:1.应用RNA干扰技术,设计合成2个特异性靶向PPA1基因的shRNA载体(PPA1-sh RNA表达载体),同时将空载体作为对照稳定转染至人卵巢癌ES2和SKOV3细胞,并对不同靶点进行有效筛选。2.应用Realtime PCR及Western blot检测目的基因PPA1的敲除效率。结果:1.本研究应用RNA干扰技术,成功建立了PPA1基因敲除的ES2和SKOV3细胞系。2.检测结果显示:和空白对照组比较,实验组的2个靶向PPA1-sh RNA干扰序列中,PPA1在RNA水平和蛋白水平均显著下调达50%以上,2个靶点敲除效率理想。结论:1.RNA干扰技术在在肿瘤学研究中具有重要的价值,同样也可以应用于EOC的研究。2.在本研究中,我们成功建立了PPA1基因敲除的ES2和SKOV3细胞系,这两组细胞系均可用于下一步实验研究。第三部分:PPA1对EOC细胞增殖、侵袭、迁移和EMT的影响目的:观察PPA1对EOC细胞的增殖、侵袭、迁移和上皮-间质转化(EMT)的影响从而观察PPA1对肿瘤生物学行为的影响。方法:1.CCK8法检测PPA1基因对EOC细胞ES2和SKOV3增殖的影响。2.Transwell法检测PPA1对EOC细胞ES2和SKOV3侵袭的影响。3.划痕实验检测PPA1对EOC细胞ES2和SKOV3迁移的影响。4.Western blot法检测PPA1对EOC细胞ES2和SKOV3 EMT相关蛋白:E-钙粘素(E-cadherin)、N-钙粘素(N-cadherin)和波形蛋白(Vimentin)表达的影响。5.免疫荧光法检测PPA1对EOC细胞ES2和SKOV3 EMT相关蛋白α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和Vimentin表达的影响。结果:1.CCK8法检测发现,PPA1基因敲除后对于EOC细胞增殖的影响不大。2.Transwell侵袭实验表明,PPA1能够增强EOC细胞的侵袭能力。3.划痕实验表明,在体外,PPA1同样能够促进EOC细胞的迁移能力。4.Western blot法检测发现,敲除PPA1基因后卵巢癌ES2和SKOV3细胞上皮性标志物E-cadherin的表达显著上调,间质性标志物Vimentin的表达显著下降。间质性标志物N-cadherin在ES2细胞的表达显著下降,而在SKOV3细胞中检测不到。5.免疫荧光法检测发现,敲除PPA1基因后卵巢癌ES2和SKOV3细胞间质性标志物α-SMA和Vimentin的表达均显著下降。结论:1.PPA1具有促进EOC细胞侵袭和迁移的能力,在体外,对于EOC细胞增殖的影响不大。2.PPA1能够促进EOC细胞的EMT。PPA1有可能通过促进EOC细胞的EMT而影响EOC的转移。第四部分:PPA1在体内对EOC细胞转移的影响目的:使用动物模型观察PPA1在体内对EOC转移的影响。方法:1.建立NOD/SCID小鼠卵巢癌腹腔移植瘤模型,观察PPA1敲除前后卵巢癌腹腔移植瘤转移能力的变化。2.活体成像法检测PPA1敲除前后卵巢癌腹腔移植瘤转移能力的变化。3.免疫组化法检测PPA1敲除前后卵巢癌腹腔移植瘤E-cadherin、Vimentin的表达变化。结果:1.本研究成功建立NOD/SCID小鼠卵巢癌腹腔移植瘤模型,并发现PPA1敲除前可见腹腔内器官及腹膜转移结节,而PPA1敲除后,转移结节少见。2.活体成像法检测也证实了PPA1有促进卵巢癌腹腔移植瘤转移的作用。3.免疫组化法检测表明,在形成的腹腔移植瘤组织中,相比对照组,敲除PPA1者EMT相关蛋白E-cadherin表达升高,而Vimentin表达降低。结论:1.本研究发现PPA1敲除后小鼠卵巢腹腔移植瘤的转移能力降低。2.在体内,PPA1具有促进卵巢癌细胞EMT的能力,从而促进EOC细胞的转移。第五部分:PPA1影响EOC转移机制的探讨目的:初步探讨PPA1影响EOC转移的机制。方法:1.Western blot法检测PPA1敲除后EOC细胞ES2和SKOV3蛋白β-catenin表达的变化。2.免疫荧光法检测PPA1敲除后ES2和SKOV3细胞β-catenin表达的变化。结果:1.Western blot法检测发现,PPA1敲除后总蛋白及核蛋白中β-catenin的表达下降。2.免疫荧光法也证实,PPA1基因敲除后的EOC细胞核的β-catenin的表达下降。结论:Wnt/β-catenin信号通路是肿瘤EMT的重要信号通路之一,PPA1可能通过调节Wnt/β-catenin信号通路影响EOC细胞的EMT,从而促进EOC的转移。