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1研究目的基于生物学效应考虑,血流剪应力可等效为药物,能调节血管内皮细胞多方面功能的量-效关系,可干预与防治动脉粥样硬化(AS)等病变。血流剪应力低下是血瘀证的共性特征,适度提高血流剪应力是活血化瘀的重要科学内涵之一。本课题从血管内皮细胞/血流剪应力/血液相互作用入手,进行以下两个层次的实验研究:(一)不同生理剪应力对离体血管AS、血栓形成及血栓溶解有关血管内皮细胞功能因子的剂量-效应关系;(二)在整体动物AS模型上研究运动与活血化瘀药对(丹参+山楂)的分别贡献与联合效应。从生物力药理学角度探讨活血化瘀防治AS的新途径与机制,促进中药药理学发展。2实验方法和结果2.1离体血管在不同剪应力和压力条件下加载模型的建立本实验应用离体血管灌流装置,建立家兔动脉血管段在不同剪应力(1.5~20dyn/cm2)和平均压力(<50000 dyn/cm2)条件下的加载模型,荧光实时定量PCR(Real-time PCR)测定不同剪应力及压力水平时实验兔动脉血管COX-1mRNA、t-PA mRNA的表达水平。结果显示:(1)只考虑剪应力效应时:剪应力在1.5~20 dyn/cm2范围内,t-PA mRNA和COX-1 mRNA相对表达量随着剪应力增加而升高,都表现为显著正相关(P<0.01),回归方程分别为y=0.0261x+0.0886和y=0.2033x+1.2082。(2)综合考虑剪应力和压力的联合效应:剪应力(X)和压力(Y)以复杂的非线性方式显著影响着COX-1 mRNA和t-PA mRNA的表达,可用二元二次方程描述,分别为COX-1 m RNA=0.3619-0.0389x+8.8645*10-7y+0.0015x2+1.515*10-6xy-3.1759*10-10y2(P<0.01)和t-PA mRNA=2.9572-0.047x-6.5219*10-5y+0.01x2+2.2973*10-6xy+6.9716*10-10y2(P<0.01)。2.2血管段灌流剪应力和压力对血管内皮细胞功能影响的联合效应研究本实验应用离体血管灌流装置,建立家兔动脉血管段在不同剪应力水平(3,8,13,18 dyn/cm2)和不同平均压力(12,24,36,48 mmHg)条件下的加载模型,放免法测定灌流剪切液中NO、ET、PGI2、vWF、PAI-1、t-PA的含量,荧光实时定量PCR法测定不同剪应力及压力水平时实验兔动脉血管COX-1、vWF、PAI-1、t-PA基因的相对表达水平。结果显示:(1)较低的剪应力(<4 dyn/cm2)和较高的压力(>40 mmHg)联合作用、或较高的剪应力(>18dyn/cm2)和较低的压力(<20mmHg)联合作用,均可使剪切液中PAI-1的含量升高,同时上调家兔血管PAI-1基因的表达。(2)中等水平的剪应力(8~18 dyn/cm2)和中等水平的压力(20~40mmHg)联合作用,可升高剪切液中t-PA的含量,同时上调t-PA基因的表达。(3)中等水平的剪应力(8~18 dyn/cm2)作用下,剪切液中vWF的含量上升,同时可上调vWF基因的表达。(4)中等水平的剪应力(8~18 dyn/cm2)和中等水平的压力(20~40 mmHg)联合作用,可使剪切液中NO/ET的值增大,使血管处于比较舒张的状态;同时,还能使t-PA/PAI-1的值增大,有利于血管内血栓的溶解。2.3丹参山楂提取物配伍与运动联合作用对大鼠动脉粥样硬化的影响采用结扎左颈总动脉、喂养高脂饲料、腹腔注射维生素D3的复合方法建立AS大鼠模型,按照两因素(丹参山楂组分配伍,游泳)四水平(0,DSA-SZA-DSL:42mg/kg-64mg/kg-12.5mg/kg,DSA-SZA-DSL:84 mg/kg-128 mg/kg-25 mg/kg,DSA-SZA-DSL:168mg/kg-256mg/kg-50mg/kg;0,10,20,40min游泳)析因设计对实验大鼠分组,实验共17组(16个析因干预组,1个假手术组)。8周后,腹主动脉取血,检测血清中血脂:总胆固醇(Total Cholesterol,T-CHO)、甘油三酯(Triglyceride,TG)、低密度脂蛋白胆固醇(Low-density lipoprotein-cholesterol,LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(High-density lipoprotein-cholesterol,HDL-C)的水平;炎症因子:白介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β)、白介素-6(Interleukin-6,IL-6)、白介素-10(Interleukin-10,IL-10)的水平;以及相关内皮细胞功能因子:内皮素(Endothelin,ET)、一氧化氮(Nitric oxide,NO)、血栓烷素B2(Thromboxane-B2,TX-B2)、6-酮-前列腺素1α(6-keto-prostaglandin F1α,6-keto-PGF1α)、血管性血友病因子(Von willebrand factor,vWF)组织型纤溶酶原激活酶(Tissue type plasminogen activator enzyme,t-PA)、纤溶酶原激活酶抑制因子-1(Plasminogen activator inhibitor-1,PAI-1)的水平。同时,取大鼠左颈动脉血管,油红O染色,观察颈总动脉血管的病理变化情况,实时荧光定量PCR法检测大鼠颈总动脉血管PAI-1、t-PA、vWF、环氧合酶-1(Cyclooxygenase-1,COX-1)基因相对表达水平。结果如下:(1)病理切片结果显示,丹参山楂提取物配伍与游泳结合可从不同程度上改善血管壁脂质沉积的情况,抑制AS斑块的发展。中剂量组丹参山楂提取物配伍(DSA-SZA-DSL:84 mg/kg-128 mg/kg-25 mg/kg)与游泳联合作用对血管脂质沉积的改善较优。(2)对血脂水平的影响丹参山楂提取物配伍和游泳在降低血清中T-CHO、TG、LDL-C的水平方面具有显著的交互作用(P<0.05),在对HDL-C的影响中,游泳的主效应非常显著(F=8.647,P<0.001)。(3)对炎症因子水平的影响在降低AS大鼠血中IL-6的水平及升高IL-10的水平上,丹参山楂提取物配伍和游泳具有显著的交互作用(P<0.05)。(4)对血管内皮因子水平的影响丹参山楂提取物配伍和游泳在升高AS大鼠血中NO和降低TX-B2的水平方面交互作用显著(P<0.05),游泳升高6-keto-PGF1α的主效应明显(F=24.675,P<0.001)。游泳和药物的交互作用能够显著影响大鼠血中PAI-1、t-PA、vWF的水平(P<0.05)。(5)对血管相关基因表达的影响低水平的运动(游泳0~10min)和中等剂量的活血化瘀药物联合应用,能抑制PAI-1基因的表达;中等水平的运动(游泳10~30 min)和中等剂量的药物联合应用,可上调COX-1基因的表达、抑制vWF基因的表达;中等水平的运动(游泳10~30 min)能上调t-PA基因的表达。3结论1.研究离体血管剪应力的生物效应时,由于压力的存在不可避免,应综合分析剪应力与压力的联合定量效应,采用三维曲面拟合方法可进行有效描述。2.血流剪应力和压力的联合作用,可通过改变离体血管舒张程度、血栓溶解能力,保护血管内皮细胞功能,改善内皮细胞功能障碍,其作用机制可能与调节v WF、PAI-1、t-PA基因的表达有关。3.丹参山楂提取物配伍和游泳联合应用具有预防大鼠AS的作用,其作用环节可能与降低AS大鼠体内血脂水平及炎症因子的分泌、调节内皮细胞分泌功能和相关内皮基因表达、改善大鼠AS脂质斑块有关。4.丹参山楂提取物配伍和定量运动(自身调节血流剪应力)对血管内皮功能的保护作用,其机制也可能与调控PAI-1、t-PA、COX-1和v WF等相关基因的表达有关。