KlebsiellapneumoniaeM5a1菌株能以3-羟基苯甲酸作为唯一碳源和能源生长。而在此菌株中，3-羟基苯甲酸的代谢是通过龙胆酸途径进行的。编码代谢3-羟基苯甲酸至丙酮酸的基因被克隆至一8kb的DNA片段上(pBSI质粒)，含有该质粒的大肠杆菌获得了以3-羟基苯甲酸作为唯一碳源和能源生长的能力。 　　通过PCR从含有肺炎克氏杆菌M5al菌株(KlebsiellapneumoniaeM5a1)中编码降解3-羟基苯甲酸的龙胆酸代谢途径基因的质粒pBSI上克隆出编码反丁烯二酸-单酰丙酮酸水解酶基因，以pET28a(+)为表达载体，与其N末端6个组氨酸标签序列融合，在大肠杆菌Rosetta中得到高效表达。基因表达产物通过亲和层析柱纯化后，酶纯度达电泳均一；SDS-PAGE测得该酶的分子量约为30.0kDa。纯化重组酶稳定性检测表明，该酶的最适反应温度为30℃左右，最适pH为7.3-7.5；对反丁烯二酸-单酰丙酮酸的Km为23.6μmol·L-1，Vmax为292.4μmol·L-1·min-1。这是纯化重组反丁烯二酸-单酰丙酮酸水解酶的第一例报道。 　　运用生物信息学相关软件分析3-HBA-6-羟化酶(MhbM)序列分析发现，3-HBA-6-羟化酶以及其同源蛋白具有一个高度保守的模体(motif)SXXR，通过OverlapextensionPCR引入点突变将S166及R169分别突变成A166和E169，经过酶学检测发现所构建的这两个突变体均失去酶活，二级结构分析发现引入点突变后酶的二级结构均没有改变，表明模体(motif)SXXR在3-HBA-6-羟化酶中起关键作用。 　　龙胆酸1，2-双加氧酶(GDO，EC1.14.13)，能够催化龙胆酸产生顺丁烯二酸-单酰丙酮酸。本研究利用龙胆酸1，2-双加氧酶基因工程菌以及MP被酸化时会转化成反丁烯二酸-单酰丙酮酸的特性小量制备了纯度分别为97.7﹪以及96.4﹪的顺丁烯二酸-单酰丙酮酸和反丁烯二酸-单酰丙酮酸，为该化合物的制备提供了一条具有一定可行性的生产途径。 　　采用移码突变构建突变体的方法鉴定了pBSI质粒部分基因在受体菌的趋化行为中所起的作用。