PTH-FC对大鼠骨髓间充质干细胞增殖及骨向分化的影响

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目的:评价PTH-FC(Parathyroid Hormone-Fc)对大鼠骨髓间充质干细胞(Bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)骨向分化的作用,筛选出PTH-FC诱导BMSCs成骨分化最佳的作用浓度和时间;方法:采用全骨髓直接贴壁法体外分离、培养SD大鼠BMSCs;分别用细胞流式术检测细胞表面标志物的表达和细胞成骨、成脂的分化能力鉴定培养的细胞是否为BMSCs;以不同浓度的PTH-FC作用于BMSCs研究其对BMSCs增殖及骨向分化的作用。分别以含PTH-FC10-7M(mol/L)、PTH-FC10-8M、PTH-FC10-9M正常培养液作用BMSCs,通过噻唑兰(Methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide,MTT)、碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase,ALP)、茜素红染色筛选出PTH-FC作用于BMSCs最佳的作用浓度;以PTH-FC最佳浓度的成骨诱导液分别诱导BMSCs作用6 h(间歇性给药)和48 h(持续性给药)通过MTT、ALP、茜素红染色和实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time fluorescence quantiative PCR,qRT-PCR)检测Runx2(Runt-related transcription factor 2)、OPN(Osteopontin)、ALP mRNA的表达观察PTH-FC作用于BMSCs的最佳的促增殖、促骨向分化的作用。结果:1.采用全骨髓直接贴壁法成功的分离培养了BMSCs;细胞流式技术检测细胞表面标志物的表达:CD34和CD45呈阴性表达,其阳性表达率分别为1.85%和1.30%;CD90和CD44的阳性表达率分别为96.69%和99.82%,证明细胞来源于骨髓间充质。经成骨、成脂诱导液诱导21d后,茜素红和油红O染色可见明显的钙结节和脂滴,表明培养的细胞为干细胞,其有多项分化的潜能;2.分别以含PTH-FC10-7M、PTH-FC10-8M、PTH-FC10-9M正常培养液作用BMSCs,通过MTT可知PTH-FC促进BMSCs的增殖,1 d、2 d时PTH-FC对BMSCs的增殖效果不明显,从第3 d起PTH-FC10-99 M促进BMSCs增殖的效果明显;通过ALP、茜素红染色可知PTH-FC10-9M促进BMSCs的骨向分化,与对照组比较其作用不明显(P>0.05);筛选出PTH-FC作用于BMSCs最佳的作用浓度为PTH-FC10-99 M;3.含PTH-FC10-9M的成骨诱导培养液作用6 h的间歇性给药组,与其他组相比,PTH-FC10-9M的成骨培养液作用6 h对BMSCs具有较高的骨向分化能力,即ALP表达显著升高,茜素红染色显示更多的钙化结节,qRT-PCR检测Runx2、OPN、ALP mRNA的表达明显高于对照组,其具有统计学意义(P<0.05);细胞增殖能力(MTT)结果表明各实验组组间无显著差异(P>0.05)。结论:1.全骨髓直接贴壁法是一种简单有效并且能获得较高纯度BMSCs的分离方法,其分离的细胞具有多向分化潜能;2.PTH-FC10-9M作用BMSCs 6h的间歇性给药组具有最佳的骨向诱导能力,这提示PTH-FC作为骨诱导生长因子联合BMSCs对骨组织缺损的修复是可行的。
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