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基因重组蛋白的复性是生物工程下游技术中的一个关键问题，因长期未能得到很好的解决，从而在很大程度上制约着生物工程产品的产业化。用液相色谱(LC)进行变性蛋白复性是近年来迅速发展起来的一种新的方法，它能够显著地提高蛋白复性效率，并同时使目标蛋白得到纯化，目前已成为国际上的研究热点。本论文应用LC对两种重组蛋白，重组牛朊病毒蛋白片断[rbPrP(104-242)]和重组人粒细胞集落刺激因子(rhG-CSF)进行了复性并同时纯化，同时还对rhG-CSF的复性并同时纯化工艺进行了放大。
论文包括以下八个部分：1.文献综述：简要地介绍了蛋白质复性的意义，对近年来发展起来的蛋白质复性新方法进行了系统的综述。也对朊病毒和rhG-CSF的复性及分离纯化研究进展进行了评述。引用文献200篇。
2.用高效疏水色谱(HPHIC)对大肠杆菌(E.coli)表达的重组牛朊病毒蛋白片断rbPrP(104-242)进行了纯化，研究了pH值、固定相和盐种类、梯度模式等几种因素对纯化结果的影响。经一步HPHIC，在40min内可以得到纯度为96％，质量回收率为87％的rbPrP(104-242)，该方法简单高效。圆二色性光谱结果表明所得rbPrP(104-242)的二级结构正确。因此，rbPrP(104-242)可以在HPHIC过程中得到纯化并同时复性。
3.成功地用普通SEC对E.coli表达的rhG-CSF进行了复性并进行了部分纯化，研究了流动相中脲浓度、流动相pH、流速、谷胱甘肽浓度和氧化还原比例，以及甘油浓度等因素对rhG-CSF的SEC复性的影响。在优化的条件下，所得rhG-CSF的比活为1.2×108IU·mg-1，其质量回收率为30.1％，所用时间为25min。采用脲梯度SEC对rhG-CSF进行了复性，研究了脲梯度的长度和最终的脲浓度对rhG-CSF复性的影响。与普通SEC相比，在流动相中有脲存在并用脲梯度是一种更有效的SEC复性rhG-CSF的方法，能够更好地抑制复性过程中聚集体的产生，所得rhG-CSF的比活为1.2×108IU·mg-1，纯度为82.1％质量回收率为52.8％，所用时间为30min。
4.采用强阴离子交换色谱(SAX)法成功地对8.0mol·L-1脲变性的rhG-CSF进行了复性并同时纯化，考察了流动相中脲浓度、流动相的pH值、流速、氧化还原对比例等对SAX复性rhG-CSF的影响。在优化的条件下，所得rhG-CSF的比活性()为3.0×108IU·mg-1，纯度为96.4％，质量回收率为49.3％，所用时间为30min。而采用稀释法所得rhG-CSF的比活性为0.93×108IU·mg-1，质量回收率为32.7％，所用时间为9h。与稀释法相比，SAX不但具有较高的复性效率，而且省略了通常稀释复性方法中的稀释、离心除沉淀、浓缩和上样等步骤。
5.将弱阴离子交换(WAX)色谱饼用于rhG-CSF的复性并同时纯化，该法可在进样时生成沉淀的条件下正常进行色谱操作。研究了流动相中脲浓度、盐种类、缓冲液、流动相的pH值、流速、氧化还原对浓度比例等对WAX色谱饼对rhG-CSF复性的影响。在此条件下，所得rhG-CSF的比活性为1.9×108IU·mg-1，纯度为95.8％，质量回收率为29.4％，所用时间为25min。
6.将固定化金属离子亲合色谱(IMAC)用于rhG-CSF的复性并同时纯化，研究了流动相中脲浓度、流动相pH、缓冲液种类和甘油浓度对rhG-CSF复性的影响。在优化的条件下，所得rhG-CSF的比活性为2.3×108IU·mg-1，纯度为98.2％，质量回收率为36.4％，所用时间为40min。而稀释法所得rhG-CSF的比活性仅为0.81×108IU·mg-1，质量回收率为27.2％，所用时间为9h。这也是首次将IMAC用于非融合蛋白的复性。
7.用HPHIC对8.0mol·L-1脲溶解的rhG-CSF进行了复性，研究了盐种类、硫酸铵浓度、缓冲液种类、流动相pH值、流速和固定相等对rhG-CSF复性的影响。在优化的条件下，经一步HPHIC后，在28min内rhG-CSF可以得到复性，并同时得到纯化，其比活为2.1×108IUmg-1，纯度为96.8％，复性及纯化过程中的质量回收率为42.6％，所用时间为23min。该工艺成本低，操作周期短，容易放大，可应用于rhG-CSF的大规模生产。
8.对HPHIC复性rhG-CSF的工艺进行了放大，用10×200mmI.D.HPHIC色谱饼在工业规模上对rhG-CSF进行了复性并同时纯化，研究了流速、起始硫酸铵浓度、梯度时间和进样方式等对复性过程的影响。10×200mmI.D.HPHIC色谱饼基本上可以负载体积为200mL，总蛋白含量约为1.6g的rhG-CSF的8.0mol·L-1脲提取液。在此条件下，所得rhG-CSF的比活为2.3×108IU·mg-1，纯度大于95.4％，质量回收率为36.9％，所用时间为140min。
本论文的研究结果表明，对rbPrP(104-242)，HPHIC效果甚佳。对几种折叠液相色谱法用于含二硫键的重组蛋白rhG-CSF的复性并同时纯化而言，用SAX、WAX、IMAC和HPHIC复性rhG-CSF时，所得复性率均高于稀释法和SEC法，其中以SAX法所得结果最好，但因其所用基质为软基质，流速不宜太大，用于工业生产时，耗时太长。用HPHIC法虽然质量回收率低于脲梯度SEC法，且与SAX法相当，但HPHIC色谱饼法容易工业放大。另外，在用LC法进行复性时，均不可避免地会产生蛋白沉淀，沉淀积累后就会使柱压急剧升高，甚至会将色谱柱堵塞，使LC复性过程不能正常进行。而HPHIC色谱饼法可在进样时生成沉淀的条件下正常进行色谱复性操作，而且可以采用间歇溶解沉淀的方法回收沉淀的蛋白，对其重新进行复性，从而提高复性率。指出固定相对蛋白质的复性有很大的影响。还对折叠液相色谱的发展进行了展望。