背景美国肿瘤协会统计结果表明,结肠癌在各类恶性肿瘤发病率及死亡率中均占第三位,放射治疗是结肠癌综合治疗中的重要组成部分,尤其是对于较晚期的结直肠癌,放射治疗的作用更显得重要,然而高剂量的放射治疗给患者带来严重并发症,某些类型结肠癌细胞对于放疗敏感性低,甚至发生放射抵抗。寻找一种理想的放疗增敏剂,既可以抑制肿瘤细胞生长,又能增加肿瘤细胞对放疗的敏感性,成为当前抗肿瘤研究的一个重要方向。DNA错配基因修复系统可以修复DNA复制和重组过程中出现的基因错配,而DNA错配基因修复系统的功能缺失会导致由DNA损伤所致的生长停滞。研究发现,人结肠癌细胞HCT116的hMLH1错配修复基因发生突变,导致微卫星不稳定性和错配基因修复缺失。和厚朴酚是从中国传统中药厚朴中分离出的联苯酚类化合物,研究表明,和厚朴酚对多种肿瘤具有生长抑制作用。目的本课题旨在研究和验证和厚朴酚对人结肠癌HCT116细胞的放疗增敏作用,检验错配基因修复系统在和厚朴酚对人结肠癌HCT116细胞的放疗增敏的调控作用,观察和厚朴酚对错配基因修复正常的HCT116-CH3细胞和错配基因修复缺失的HCT116细胞的放疗增敏作用的差异。探讨hMLH1基因对于和厚朴酚在人结肠癌细胞放疗作用的可能调控机制。实验方法首先通过联合应用不同浓度与剂量的和厚朴酚(10umol/ml,20umol/ml,30umol/ml,40umol/ml,50umol/ml)与γ-射线(0,2.5,5.0Gy)作用于人结肠癌细胞(HCT116、HCT116-CH2和HCT116-CH3细胞),分别作用24h、48h、72h,观察和厚朴酚对人结肠癌细胞的生长抑制和放疗增敏作用；平板细胞集落形成实验可进一步验证和厚朴酚作用的远期效果；采用流式细胞术分析和厚朴酚及γ-射线作用后细胞周期调控情况,Caspase3,7活性分析实验检测凋亡的发生,再通过Western Blotting蛋白印迹实验和RT-PCR检测检测凋亡相关蛋白表达水平及RNA复制水平的变化。结果单用和厚朴酚或和厚朴酚联合γ-射线对三个细胞系的细胞增殖和克隆形成均有明显的抑制作用,且呈显著的剂量-,时间-依赖性。然而,抑制效果在hMLH1缺陷型的HCT116、HCT116-CH2细胞更为显著。单用和厚朴酚作用48小时的IC50是40umol/ml,单用Y-射线ID50需剂量为5Gy作用72小时,而联用和厚朴酚与γ-射线细胞增殖IC50为25umol/ml HNK+2.5Gy γ-射线作用48小时,和厚朴酚对人结肠癌细胞放疗增敏作用较明显。经25umol/ml HNK+2.5Gy γ-射线作用48小时,hMLHl缺陷型HCT116细胞与hMLHl完整型HCT116-CH3细胞的增值分数分别是41.55%和68.02%；与hMLHl完整型HCT116-CH3细胞比较,联用和厚朴酚和Y-射线可以使hMLHl缺陷型HCT116细胞的Caspases系统激活与P-p53蛋白表达更为显著。在hMLHl完整型HCT116-CH3细胞组中P-p53蛋白表达的水平极低,而促凋亡基因Bax的表达水平比hMLHl缺陷型HCT116细胞显著升高,抑凋亡基因Bcl-2表达则显著下降。流式细胞术细胞周期分析发现和厚朴酚与Y-射线联合作用后,可诱导较高水平的细胞凋亡,在HCT116细胞组,凋亡现象发生更加显著。联合应用可以导致G0/G1期,G2/M期细胞阻滞,Western Blotting检测HCT116和HCT116-CH3细胞系均有cyclin Bl与Cyclin Dl的表达水平下降,而HCT116细胞作用后下降的更为明显,提示hMLHl的高水平表达能够降低和厚朴酚对人结肠癌细胞的放疗增敏作用。结论1、和厚朴酚是一种非常有效的结肠癌细胞放疗增敏剂,尤其是对错配基因修复功能缺陷的结肠癌细胞效果更明显；2、和厚朴酚可以导致人结肠癌细胞发生G0/G1期阻滞；3、和厚朴酚联合Y-射线作用人结肠癌细胞凋亡增加；4、hMLHl gene可能通过抑制P53蛋白的功能活性来降低和厚朴酚对人结肠癌细胞的放疗增敏性。