弯曲菌(Campylobacter)是全球范围内最常见的细菌性肠道病原菌,对人类致病的主要是空肠弯曲菌和结肠弯曲菌,能引起散发性和地方流行性的胃肠炎暴发,由其引起的弯曲菌病病例在世界各地普遍呈上升趋势。弯曲菌广泛存在于家禽家畜的肠道和自然环境中,水禽是导致人弯曲菌感染的潜在宿主,感染的动物通常无明显病症,但可长期向外界排菌,通过排泄物污染食物和饮水,引起人类及其它动物感染。因此,控制或清除水禽弯曲菌是预防和控制人弯曲菌感染的重要前提之一。本文研究的主要目的是:(1)较为系统地调查与分析水禽中弯曲菌的流行现状与特点,对分离株进行耐药性分析。(2)通过构建重组标签空肠弯曲菌分析弯曲菌在水禽和家禽之间可能的传播途径。(3)应用多位点序列分型技术(Multilocus sequence typing, MLST)对不同源空肠弯曲菌分离株进行分子分型研究,探究菌株间的分子流行病学特征及种群结构。一、水禽弯曲菌流行现状和耐药性调查与分析2007年12月至2009年12月,采集江苏部分地区的鹅源、鸭源和江苏、山东、安徽鸡群样品进行空肠弯曲菌和结肠弯曲菌流行病学调查。15个水禽群体中,空肠弯曲菌阳性的有12个、阳性率为80.0%,结肠弯曲菌阳性的有7个、阳性率为53.33%。在2182份水禽泄殖腔棉拭样品中,共检测出380份空肠弯曲菌阳性、阳性率为17.42%,16份结肠弯曲菌阳性、阳性率为0.73%,其中空肠弯曲菌和结肠弯曲菌混合感染的样品为6份,阳性率为0.27%。其中,在850份鹅泄殖腔棉拭样品中,空肠弯曲菌平均阳性率为34.94%、结肠弯曲菌平均阳性率为0.82%;在1332份鸭群泄殖腔棉拭样品中,空肠弯曲菌阳性率为6.23%、结肠弯曲菌阳性率为0.68%。不同水禽群感染率悬殊较大,空肠弯曲菌阳性率从0到65.52%、结肠弯曲菌阳性率从0到1.85%。数据分析显示,鹅群空肠弯曲菌感染率极显著高于鸭群感染率( p<0.01),活禽市场鹅群感染率显著高于养殖场中鹅群感染率( p<0.05);活禽市场鸭群空肠弯曲菌感染率极显著大于养殖场中鸭群感染率( p<0.01)。在960份鸡泄殖腔棉拭样品中,共检测出251份空肠弯曲菌阳性、阳性率为26.15%,36份结肠弯曲菌阳性、阳性率为3.75%,其中空肠弯曲菌和结肠弯曲菌混合感染的样品为15份、阳性率为1.56%;不同鸡群感染率悬殊较大,空肠弯曲菌阳性率从7.58%到73.08%、结肠弯曲菌阳性率从0到5.77%。5个鸡群均为空肠弯曲菌阳性,群体阳性率为100%、结肠弯曲菌群体阳性率为80%,数据分析显示,规模化圈养条件下鸡群的空肠弯曲菌携带率显著高于散养鸡(p<0.05)。进一步的流行病学调查表明,混合养殖方式中鹅群和鸡群的空肠弯曲菌感染率极显著高于单一养殖方式的感染率(p<0.01)。水禽弯曲菌流行病学调查表明,水禽特别是鹅群是弯曲菌的重要宿主,是弯曲菌感染流行和环境污染的重要因素。54株鹅源、36株鸭源和11株鸡源分离株的耐药性分析显示,对8大类20种抗生素高度敏感的是:阿齐红霉素(AZM) 96.04%、红霉素(E) 91.09%、庆大霉素(CN) 82.18%,高度耐药的是:头孢哌酮(CFP)100.00%、青霉素G (P)93.07%、头孢拉定(CE)98.02%、恩诺沙星(ENR)80.2%、环丙沙星(CIP)82.18%、复方新诺明(SXT)97.03%、四环素(TE)83.17%、强力霉素(DO)82.18%。耐药菌株的多重耐药分布于4耐到18耐不等,其中11耐至12耐最多,占47.52%。不同禽源空肠弯曲菌分离株药敏试验结果比较表明,分离株均对头孢菌素类的头孢哌酮和头孢拉定、青霉素G及磺胺类药物产生了很强的耐药性,水禽源分离株对头孢克罗产生的耐药性显著低于鸡源(p<0.01),而对喹诺酮类和四环素类抗生素,虽然水禽源分离株也产生了较强的耐药性,但低于鸡源分离株的耐药性。对其它种类抗生素,各不同源分离株之间的耐药性差别较小。二、鸡空肠弯曲菌对水禽传播途径分析鸡群是全球公认的弯曲菌的主要宿主之一,为研究鸡群体内空肠弯曲菌能否传播给水禽,本研究通过构建重组质粒pUOA18-dsRed,并将其用电转化的方法转化至空肠弯曲菌分离株SOC0612-2,成功获得重组菌SOC0612-2-pUOA18-dsRed,体外稳定性实验表明质粒pUOA18-dsRed在无抗性CCDA固体培养基上经过连续传代25次后仍能稳定存在。将该重组菌作为标签细菌研究空肠弯曲菌在水禽和鸡之间可能的传播途径。动物实验中,动物分成5个试验组,每只动物从1日龄养至4周龄。第一组放置8只笼养鸭子,接种方式为肌肉注射;第二组平行放置两个笼子,分别各养殖8只鸡和鸭子,接种方式为对鸡进行口服;第三组放置8只笼养鸭子,每日将第二组鸡的粪便喂食于改组鸭子;第四组放置笼养的鸡鸭混合饲养,鸡鸭各8只,接种方式为对鸡进行口服;第五组放置两个笼子,分别各养殖8只鸡和鸭子,作为空白对照。空肠弯曲菌在水禽与鸡之间的传播实验表明,在第3、6、9、12、15、18天各组鸭子泄殖腔的检测结果显示,鸡鸭混合养殖组中的鸭子首先被重组标签空肠弯曲菌感染,鸭子感染的数量一直呈现上升的趋势,其它组鸭子(除空白组之外)均在第6天被重组空肠弯曲菌感染,感染的数量也呈现一种上升的趋势。在第18天的检测结果中,经粪便传播和鸡鸭混合养殖的两组均有超过一半的鸭子被感染,其它两组也有一半的鸭子被感染。鸡、鸭混合养殖组中,鸭子首先被空肠弯曲菌感染,泄殖腔排菌量约为1250CFU/只,并在第6天达到最高排菌量,约为4000CFU/只,其它三组鸭子也均在第6天达到最高排菌量。之后随着时间的推移,各组鸭子排菌量保持水平趋势。研究表明,水禽与鸡之间的空肠弯曲菌以多种途径进行传播,呈现多样化和复杂化,但主要以消化道传播为主。同时,鸡群周围的粪便、饲料和水以及环境中的空气粉尘均对水禽的感染具有重要影响。不同禽群的分开养殖以及保持良好的养殖环境卫生将有助于降低弯曲菌感染传播。三、不同源空肠弯曲菌分离株多位点序列分型研究选取空肠弯曲菌7个管家基因aspA、glnA、gltA、glyA、pgm、tkt、uncA,对不同来源的167株空肠弯曲菌分离株和2株标准株进行多位点序列分型研究。结果表明,167株分离株共分成94种不同的序列型,分属18种同源复合体和独特型。有60株细菌分属45个新序列型,其中,20株细菌存在新等位基因序列,新等位基因序列的数量分别为aspA(n=3)、glnA(n=5)、gltA(n=5)、glyA(n=2)、pgm(n=1)、tkt(n=6) ,uncA中没有新等位基因序列。等位基因数量最多的是glnA(n=26),最少的是uncA(n=11)。94种不同的序列型中,属于ST-353同源复合体的序列型有9种,占总序列型的9.57%,ST-21、ST-45、ST-52和ST-692同源复合体各包含6种序列型,分别占总序列型的6.38%。另外,属于独特型的序列型共27种,占总序列型的28.72%。包含菌株数最多的同源复合体是ST-353,共有20株,占总分离株的12.0%,其次为ST-354同源复合体和ST-45同源复合体。具有同源复合体的菌株占总数的76.6%,属于独特型的细菌占总分离株的23.4%。含菌株数排前8位的同源复合体涵盖了102株,占总数的61.1%。人源、鸡源、牛源、食品源、宠物源和水禽源分离株中这8种主要同源复合体所包含的分离株分别占该来源分离株的51.70%、60.40%、65.00%、80.00%、80.00%和68.40%,为优势同源复合体。包含菌株数最多的序列型ST-354,共有11株,占总数的6.59%,含有2株或2株以上分离株的序列型共有35种,其余59种序列型只含有1株细菌。60株人源分离株中,属于独特型的分离株共18株,除此之外,ST-353同源复合体包含的人源菌株最多,共有12株细菌,占人源总分离株的20.0%;48株鸡源分离株中,属于独特型的分离株共13株,除此之外,ST-354和ST-574同源复合体包含的鸡源菌株最多,分别含有10株和9株细菌,分别占鸡源总分离株的20.83%和18.75%;20株牛源分离株中,ST-22同源复合体含有9株细菌,占牛源总分离株的45.0%;10株食品源分离株中,8株细菌分属ST-353、ST-354和ST-45同源复合体;10株宠物源分离株分属6种同源复合体,其中含菌株最多的是ST-45同源复合体,共3株;19株水禽源分离株中,7株细菌属于ST-692同源复合体,占36.84%。在所获得的94种序列型中,共有21种序列型含有两种或两种以上不同来源的空肠弯曲菌分离株,其中ST-354和ST-137两种序列型分别各含有4种不同来源的分离株,另有19种序列型含有2种不同来源的空肠弯曲菌分离株。21种序列型所包含的细菌中,含有人源的序列型有15种,该15种序列型中除了含有人源分离株之外,同时还含有其它来源细菌。通过UPGMA作图对空肠弯曲菌进行遗传聚类分析,选择相邻序列型之间有4个或4个以上的管家基因位点序列是相同的,可将167株分离株和两株标准株共96种序列型分为9个克隆组群和1个单独型,其中组群5占有的序列型最多,达55种序列型。分子分型研究表明,MLST可作为研究空肠弯曲菌传播来源、分子流行病学和种群结构研究的有力工具。人源、鸡源、牛源、水禽源、食品源和宠物源空肠弯曲菌分离株之间的遗传关系分析显示,同一种同源复合体和同一种序列型包含不同来源空肠弯曲菌分离株,表明动物和禽肉食品与人类感染空肠弯曲菌密切相关,可能存在相同的传染源,而且动物和禽肉食品源弯曲菌是人类弯曲菌病的主要传染源之一。