目的卵巢癌（Ovarian Cancer,Ov Ca）是在妇科恶性肿瘤中致死率排名第一位的肿瘤。卵巢癌起病隐匿,难于早期诊断,大部分患者在诊断时已进展至晚期。由于缺乏可靠的指标,卵巢癌的早期诊断和预后都是亟待解决的临床难题。此外,虽然卵巢癌的靶向治疗不断发展,但由于低应答率和耐药性的问题,仍有相当一部分患者难以从现有的靶向治疗中获益。基于此,寻找在卵巢癌早期就能够帮助诊断和预测患者预后情况,以及有望作为卵巢癌治疗靶点的新的生物标记物,成为卵巢癌诊断和治疗领域迫切需要解决的问题。生物信息学是生命科学与计算机科学相结合形成的一门新兴的交叉学科。近年来,随着GEO、TCGA等多个全球性肿瘤数据库不断建立和完善,肿瘤数据库的信息提取和深入挖掘已经成为了肿瘤研究的热点和重点。利用生物信息学方法挖掘肿瘤数据库的已有数据,有针对性地获取肿瘤相关分子,是获得有效生物标记物、筛选信号通路分子进而揭示肿瘤发生、发展内在机制的高效方法,运用该方法能够大大提高筛选诊断、预后和治疗靶标的效率和可靠性。因此,在本课题中,我们拟通过对GEO数据库、TCGA数据库等在线数据库中的卵巢癌相关数据进行数据挖掘,分析获得卵巢癌m RNA表达谱中的差异表达基因,结合多种生物信息学方法从这些差异表达基因中筛选获得能够显著影响卵巢癌患者生存期、帮助预测患者预后情况的生物标记物,再通过对目的基因功能和调控网络的研究,进一步了解目的基因在卵巢癌中发挥的作用及其调控机制,为该分子作为辅助诊断、预后预测因子或进一步作为治疗靶标应用于临床,提供理论依据。材料与方法1.GEO卵巢癌基因芯片数据挖掘、差异表达基因分析和目的基因筛选1)GEO卵巢癌数据集的检索、筛选和下载;使用R软件从质量灰度、权重、残差、残差符号、RLE、NUSE和RNA降解等多个方面对拟进行分析的基因芯片数据进行质量评估;2)对选取的4个GEO卵巢癌数据集进行数据预处理,剔除不合格样本后,使用RMA算法分别进行背景校正、标准化和log2处理,再将对照组和肿瘤组数据进行合并、汇总,通过Affymetrix平台的芯片注释文件,将探针ID转换为基因名称;分别对每个卵巢癌数据集进行差异表达分析;3)使用DAVID在线工具对差异表达基因进行GO和KEGG富集分析;根据GO分析结果对增殖相关的差异表达基因进行筛选;4)使用Kaplan-Meier Plotter工具进行备选基因的OS和PFS生存分析,并绘制生存曲线;5)使用Oncomine公共数据平台进行备选基因表达分析和验证;6)使用GEPIA数据库对候选基因在不同分期的卵巢癌中的表达进行分析。2.KIF15在卵巢癌的表达验证和体内外功能研究1)利用GTEx来源的人体正常组织RNA-seq数据和TCGA来源的卵巢癌样本RNA-seq数据对KIF15在正常人体组织器官的表达和在卵巢癌中的差异表达进行分析;2)利用文献中报道的干细胞指数m RNAsi数据,采用WGCNA法揭示KIF15与卵巢癌干细胞增殖的相关性;3)免疫组化法检测卵巢癌组织芯片中KIF15蛋白的表达,并对免疫组化染色结果的评估;4)使用CCLE肿瘤细胞数据库获得45种卵巢癌细胞株的KIF15 m RNA数据,了解KIF15 m RNA在卵巢癌细胞株中的表达谱;5)Real time-PCR检测包括卵巢癌细胞株SKOV3、A2780、HO8910和Ovcar-3,宫颈癌细胞株Hela、Siha和C33a,肺腺癌细胞株A549、胰腺癌细胞株PANC-1和神经胶质母细胞瘤细胞株U87等多种肿瘤细胞株中KIF15 m RNA的表达;6)对卵巢癌细胞株进行sh RNA慢病毒转染,Real-time PCR和Western Blot法检测慢病毒转染效率;7)Celigo法细胞计数和CCK8法检测KIF15敲减后细胞增殖情况;8)FACS法和Caspase3-7法检测KIF15敲减后细胞凋亡情况;9)裸鼠成瘤实验及动物活体成像,观察成瘤情况,并对瘤体进行抗KIF15免疫组化染色。3.敲降KIF15卵巢癌细胞样本的基因表达谱检测与生物信息学分析1)对SKOV3细胞进行Sh RNA慢病毒感染,RT-PCR法验证敲降KIF15的效率;2)从A260/A280比值、RIN值和28s/18s比值三个指标,对总RNA的质量进行评估;3)使用3′IVT反应法对基因芯片进行检测;4)从质量灰度、权重、残差、残差符号、RLE、NUSE等多个方面对基因芯片质量进行分析;5)进行差异表达基因分析;6)运用基因富集分析工具Fun Rich、Clue GO和GSEA等不同方法对差异表达基因进行功能和信号通路的富集分析,筛选出凋亡相关的通路;4.敲降KIF15卵巢癌细胞样本的磷酸化蛋白芯片检测与生物信息学分析1)使用磷酸化蛋白芯片对敲降KIF15的SKOV3细胞样本进行检测,并对原始图片进行扫描和分析;2)依据m RNA基因表达谱的分析结果从磷酸化蛋白芯片的数据中筛选出对应的凋亡相关通路及通路上的分子,构建磷酸化蛋白核心网络;3)分别从m RNA水平和蛋白水平对三条信号通路上的分子作重叠性分析,确定三条凋亡相关通路的交叉分子,验证敲降KIF15是通过调控三条凋亡相关通路交联形成的网络发挥促凋亡作用的。结果1.GEO卵巢癌基因芯片数据挖掘、差异表达基因分析和目的基因筛选结果1)经过多个指标的评估,认为本研究选用的芯片质量较为可靠,可以进行后续数据分析;2)以|Log FC|≥1.5和p<0.05为差异基因的筛选标准;GSE40595数据集包含上调基因2544个,下调基因52个;GSE18520数据集包含上调基因582个,下调基因580个;GSE38666数据集包含上调基因1487个,下调基因205个;GSE36668数据集包含上调基因2216个,下调基因108个;4个数据集具有共同上调差异表达基因183个,下调差异表达基因7个;3)GO分析结果中,我们选取p值最小的前10位GO分类,其中与增殖相关的有5个,包括“cell division”,“mitotic nuclear division”,“cell proliferation”,“mitotic sister chromatid segregation”和“chromosome segregation”。在这5个GO分类的共42个基因中,存在17个富集于2个或2个以上细胞增殖相关GO分类的基因（SAC3D1,NUF2,FAM83D,TPX2,KIF11,ZWINT,CDCA3,NDC80,PTTG1,BUB1B,KIF15,KIF18B,SPAG5,CENPF,CDC20,CDK1 and KIF2C）;4)在Kaplan-Meier Plotter中进行生存分析,上述17个基因中,BUB1B,CDK1,CENPF,FAM83D、TPX2和KIF15等6个基因均与卵巢癌患者的总生存率（OS,p<0.01）和无进展生存率（PFS,p<0.05）呈负相关;5)在Oncomine数据库中,上述6个基因除FAM83D外均有权威数据集TCGA支持其m RNA在卵巢癌组织中存在差异表达,因此我们对其余5个基因进行进一步分析;6)BUB1B,CDK1,CENPF,TPX2和KIF15 m RNA的表达均与stage I-II期卵巢癌患者的PFS和OS呈明显负相关,且这些基因高表达于I-II期卵巢癌患者时较卵巢癌患者总体具有更大的风险比HR值;7)BUB1B、CENPF和KIF15在不同分期的卵巢癌组织中表达具有显著性差异,且早期（stage II）表达高于中晚期（stage III和IV）,这种差异在KIF15（F=5.03,p值=0.00692）高于BUB1B（F=4.7,p值=0.00954）和CENPF（F=3.8,p值=0.0232）。2.KIF15在卵巢癌的表达验证和体内外功能研究结果1)KIF15 m RNA在人体正常组织器官中,除骨髓外,均为低表达;在卵巢癌组织中存在过表达;2)WGCNA分析揭示了KIF15与卵巢癌细胞的干性调控相关,并参与卵巢癌干细胞的增殖调控;3)免疫组化染色提示KIF15蛋白仅存在于胞浆中。在90例不同病理类型的卵巢癌组织中,有68例（75.6%）存在KIF15蛋白的高表达,22例（24.4%）低表达,而在10例癌旁组织中,有2例（20%）高表达,其余8例（80%）均为低表达,KIF15蛋白在卵巢癌和癌旁组织中表达水平的差异具有显著性（p<0.05）;该组织芯片中除去10例癌旁组织和10例淋巴结转移腺癌,其余80例卵巢癌组织中,包括64例临床分期为I-II期的样本,其中KIF15高表达样本有49例（76.6%）;其余16例III-IV期样本中,KIF15高表达的有11例（68.8%）。在不同的病理类型中,5例透明细胞癌中有3例KIF15高表达（60%）),11例粘液性腺癌中有8例高表达（72.7%）,1例子宫内膜样腺癌为高表达,其余63例浆液性腺癌中,有49例（77.8%）高表达KIF15在不同的病理类型中,5例透明细胞癌中有3例KIF15高表达（60%）),11例粘液性腺癌中有8例高表达（72.7%）,1例子宫内膜样腺癌为高表达,其余63例浆液性腺癌中,有49例（77.8%）高表达KIF15。上述结果提示,KIF15蛋白在早期卵巢癌患者的组织中就有广泛的高表达,在不同病理类型的卵巢癌中均有广泛的高表达,没有明显的病理类型特异性。在包括妇科常见恶性肿瘤卵巢癌、宫颈癌和肺腺癌、胰腺癌、神经胶质母细胞瘤在内的10种肿瘤细胞株中,SKOV3的KIF15 m RNA表达最高,HO8910表达最低,其余8种细胞株的KIF15 m RNA表达量都介于这两种细胞株之间,本课题将SKOV3和HO8910两种细胞株作为我们后续功能实验中的细胞株;4)Sh RNA慢病毒对SKOV3的敲减效率为83.1%,HO8910的敲减效率为61.0%,可以满足后续实验的需要;5)Celigo细胞计数:将Day5这个观察时间节点的SKOV3细胞的细胞数与Day1的细胞数进行比较,Sh Control的细胞增殖倍数是7.63±0.11倍,Sh KIF15组的细胞增殖倍数是1.24±0.03倍,组间比较具有显著性差异(t检验,p值=6.82701×10^-8);HO8910细胞Sh Control的增殖倍数是5.65±0.19倍,Sh KIF15组的增殖倍数是1.72±0.07倍,组间比较也具有显著性差异(t检验,p值=7.10173×10^-11),提示敲降KIF15能够显著抑制细胞增殖;6)CCK8法检测:SKOV3 Sh Control组Day5的OD值是Day1 OD值的4.095±0.0294倍,Sh KIF15组Day5的OD值是Day1 OD值的2.483±0.038倍,HO8910Sh Control组Day5的OD值是Day1 OD值5.11±0.0291倍,Sh KIF15组Day5的OD值是Day1 OD值的2.416±0.0268倍,同种细胞组间进行比较,均具有显著性差异(t检验,SKOV3 p值=1.11593×10^-12,HO8910 p值=3.85188×10^-15),进一步验证了敲降KIF15能够显著抑制卵巢癌细胞增殖;7)FASC法检测细胞凋亡:在慢病毒感染后的72h对KIF15敲减后SKOV3和HO8910细胞的凋亡情况进行检测,SKOV3细胞Sh KIF15组凋亡细胞的比例是6.4±0.255%,Sh Control组的凋亡细胞比例是2.98±0.192%,HO8910 Sh KIF15组的凋亡细胞比例是10.58±0.577%,Sh Control组的凋亡细胞比例是4.03±0.142%。两种细胞Sh KIF15组的凋亡细胞比例均显著高于sh Control组(t检验,SKOV3 p值=5×10^-5,HO8910 p值=4×10^-5),提示敲降KIF15能够显著促进卵巢癌细胞凋亡;8)Caspase3-7法检测细胞凋亡:该方法所检测的发光信号的强弱程度与Caspase-3/7的活性成正比。在SKOV3和HO8910细胞中,sh KIF15组的发光信号强度（即Caspase活性的指标）均明显高于Sh Control组（t检验,SKOV3 p值=0.000847283,HO8910 p值=0.000283606）,提示sh KIF15组细胞凋亡率显著高于Sh Control组,进一步验证了KIF15敲减能够显著促进卵巢癌细胞凋亡;9)动物活体成像:注射Sh Control慢病毒感染的SKOV3的NC组10只裸鼠注射部位均显示不同强弱程度的荧光表达,提示皮下均有瘤体形成;而注射Sh KIF15慢病毒感染的SKOV3的KD组10只裸鼠,仅有1只裸鼠注射部位可见荧光信号,其余裸鼠均未见有明显的荧光信号,提示仅有1只裸鼠皮下有瘤体形成;10)裸鼠皮下成瘤:NC组的瘤体重量是1.482±0.273g,KD组只获得一枚皮下成瘤样本,肿瘤是0.061g,NC组的瘤体重量与KD组比具有显著性差异（t检验,p值=8.442×10-11）,提示KIF15敲减后的SKOV3细胞在裸鼠体内的成瘤能力明显下降;11)NC组瘤体抗KIF15免疫组化染色呈棕褐色,KD组呈淡黄色,提示在上述荷瘤实验所获得的瘤体中,KD组瘤体中的KIF15蛋白表达明显低于NC组。3.敲降KIF15的SKOV3细胞样本的基因表达谱检测与生物信息学分析1)总RNA质量分析:6个待测样本RNA纯度较高,完整性较好,质量合格,适合进行基因芯片分析;2)基因芯片质量分析:本研究中所用芯片和样本均质量可靠,这也是后续实验中数据分析可靠性的保证;3)差异表达基因分析结果:KD组与NC组进行比较,以|FC|≥1.5,p value值<0.05为标准对差异表达基因进行分析,筛选出表达上调基因134个,下调基因309个;4)Funrich软件功能和通路富集分析:在上调基因中,可以观察到生物过程主要富集于核酸代谢、细胞通讯和信号转导等过程,信号通路主要富集于Er Bb、TRAIL、PI3K/Akt等肿瘤相关通路和细胞粘附（Cell adhesion）相关通路中;在下调基因中,富集基因比例排在前三位的生物过程分别是蛋白代谢、抗凋亡（Anti-apoptosis）和蛋白定位,且信号通路富集（p<0.05）的前11条通路中有4条都与凋亡（Apoptosis）相关,依次是凋亡因子介导反应（Apoptotic factor-mediated reponse）,SMAC介导的IAP caspase复合物的解离（SMAC mediated dissociation of IAP:caspase complex）,SMAC结合IAPs（SMAC binds to IAPs）和SMAC介导凋亡反应（SMAC mediated apoptotic response）;5)Clue GO法通路富集分析:Apoptosis,TNF signaling pathway和NF kappa B signaling pathway三条信号通路是所有通路富集分析结果中囊括基因最多、最主要的通路,且均与凋亡相关;6)GSEA法富集分析:Apoptosis和TNFαsignaling via NFkb是上述差异基因的凋亡相关分子特征。4.敲降KIF15的SKOV3细胞样本的磷酸化蛋白芯片检测与生物信息学分析1)在蛋白水平上,敲降KIF15引起了Apoptosis,TNF signaling pathway和NF kappa B signaling pathway三条凋亡相关信号通路的激活;2)Apoptosis,TNF signaling pathway和NF kappa B signaling pathway三条凋亡相关信号通路在m RNA水平和蛋白水平均存在相互交联,构成凋亡相关调控网络;3)三条凋亡相关通路在m RNA水平上的交叉分子为MAP3K14和TNF,在蛋白水平上的交叉分子为NFk B-p105/p50,Phospho-Ser337、IKK-beta,Phospho-Tyr199、NFk B-p65,Phospho-Ser529和IKK-gamma,Phospho-Ser31,上述蛋白分子均存在显著的磷酸化,提示功能的激活。结论KIF15是卵巢癌中具有早期辅助诊断和预后预测价值的增殖相关基因。敲降在卵巢癌KIF15能够在体外显著抑制卵巢癌细胞的增殖,促进其凋亡,在体内亦能够明显抑制卵巢癌细胞成瘤。这种作用是敲降KIF15抑制细胞增殖和促进细胞凋亡的共同结果。敲降KIF15通过Apoptosis、TNF signaling pathway和NF kappa B signaling pathway三条凋亡信号通路相互交联形成的调控网络的激活促进卵巢癌细胞的凋亡。因而,KIF15有望作为有效的治疗靶点应用于临床。