白及多糖水凝胶促皮肤伤口愈合作用研究

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白及Bletilla striata(Thunb.)Reichb.f.为兰科(Orchidaceae)多年生草本植物,是我国传统的止血生肌要药。白及多糖(Bletilla striata polysaccharide,BSP)被认为是白及重要的生物活性成分之一,现代药理学实验表明,BSP具有良好的生物相容性且兼具抗氧化、抗肿瘤、抗衰老、免疫调节和促伤口愈合等生物活性。同时,因其单糖组成简单,富含羟基易于修饰和改性,已然成为目前食品、医药和化妆品等领域的研究热点之一。创伤作为一种普遍的日常皮肤损伤,其创面一旦形成,不但影响个体美观,严重者更会危及生命。据统计,中国每年用于病患伤口护理的费用达到600亿元,而美国此项支出则高达250亿美元。因此,基于筛选生物活性成分,并探究其促进创面愈合、缩短伤口愈合时间的研究成为本领域内亟待解决的关键问题之一。本论文以我国传统药物白及为材料,提取其粗多糖并进一步分离、纯化得到BSP,利用化学方法和波谱学技术探究BSP的理化性质及结构;制备氧化白及多糖(OBSP)并与壳聚糖(CS)通过席夫碱反应成胶,对构建的白及多糖水凝胶进行充分的表征研究;选择巨噬细胞Raw264.7和原代腹腔巨噬细胞两种模型,通过ELISA试剂盒检测样品处理后巨噬细胞分泌细胞因子水平,探究凝胶对巨噬细胞极化的影响;并以小鼠全层皮肤切除模型为研究对象,通过伤口愈合率、创面定植细菌数、各细胞因子的含量和组织病理学等指标评估凝胶的促伤口愈合活性。主要研究结果如下:(1)利用水提醇沉法提取白及粗多糖,其得率为26.31%;白及粗多糖经DEAE-52纤维素柱和Sephadex G-100凝胶柱纯化得到BSP,分别利用离子色谱(IC)、高效凝胶色谱(HPGPC)、傅里叶变换红外光谱(FT-IR)、甲基化分析、气相色谱-质谱联用(GC-MS)和核磁共振(NMR)充分解析其结构特征。实验结果显示BSP是一种相对分子量为58461 Da,结构可能为→4)-β-D-Glcp-(1→[4)-α-D-Manp-(1]2→4)-α-D-2ace-Manp-(1→的链状葡甘聚糖。(2)使用高碘酸氧化法制备了氧化白及多糖(OBSP),利用1H NMR证明OBSP中醛基的生成;通过醛基和氨基的席夫碱反应制备白及多糖水凝胶,实验结果显示该凝胶表现出良好的流变、溶胀和自愈合性能,具有较低的体外降解率,合适的水蒸气透过率和一定的体外抗菌活性;此外,该水凝胶呈负电荷且无显著的溶血和细胞毒性。(3)选择巨噬细胞RAW264.7和原代腹腔巨噬细胞两种模型,综合评估白及多糖水凝胶对巨噬细胞极化的调节作用。实验结果显示凝胶能够促进巨噬细胞向M2型极化,降低炎症因子TNF-α和IL-6的表达水平,提高抑炎因子IL-10和生长因子TGF-β1的分泌,进而间接促进L929成纤维细胞的增殖。(4)利用小鼠全层皮肤切除模型在体评估白及多糖水凝胶的促伤口愈合活性。实验结果表明,凝胶可有效抵御创面细菌感染,降低炎症反应,从而缩短伤口愈合时间。
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