猪圆环病毒病的病原比较诊断及血清抗体间接ELISA诊断方法的建立和初步应用

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目的:(1)比较猪圆环病毒Ⅱ型(PCV2)的病原诊断方法。(2)建立PCV2血清抗体的间接ELISA方法。方法:(1)将14份PCR检测为PCV2阳性的病料,经过常规处理后接种于PK-15细胞,盲传3代后,应用本室已建立的PCR方法将第3代细胞毒扩增鉴定。同时,应用D(+)-氨基葡萄糖处理至第5代,测定D(+)-氨基葡萄糖处理对PCV2病毒分离和传代的影响.(2)通过比较差速离心、蔗糖不连续梯度离心、氯化铯等密度梯度离心和氯仿抽提结合超速离心等四种方法纯化PCV2抗原的包被效果,以确定最佳的PCV2包被抗原纯化方法。在此基础上,通过全病毒抗原最适包被浓度和二抗HRP-SPA浓度的确定,待测血清稀释度,封闭液的确定,封闭时间的确定,HRP-SPA反应时间的确定,临界值的确定,特异性测定,重复性测定等建立并进一步优化检测PCV2抗体的间接ELISA方法。结果:(1)14份PCR检测PCV2阳性的病料,接种于PK-15细胞,盲传3代后分离到6株PCV2,病毒分离阳性率为42.83%(6/14),同时应用本室建立的PCR方法重复对14份PCV2阳性病料扩增均仍为阳性。(2)将盲传3代后分离到的6株PCV2继续传代至第5代,D(+)-氨基葡萄糖处理组有4株阳性(4/6),未处理组仅有1株阳性(1/6),同时发现处理组PCR扩增条带明显比未处理组亮。(3)氯仿抽提结合超速离心纯化PCV2抗原的包被效果最佳,氯化铯密度离心次之。(4)用氯仿抽提结合超速离心的方法纯化的PCV2包被抗原的最佳浓度为1μg/孔/100μL,待测血清稀释度1∶80,二抗HRP-SPA的最佳工作浓度为1∶30000。优化建立的检测PCV2抗体的间接ELISA方法与CSFV、PRV和PRRSV的阳性血清不发生交叉反应,具有较好的特异性.该法与进口PCV2-ELISA试剂盒(IDXXX产品)比较,阳性符合率为92.86%(13/14)、阴性符合率为87.1%(27/31)、总符合率为88.89%(40/45)。(5)应用该方法,检测了福州,南平,三明,漳州,莆田等地市17个猪场309份血清,PCV2抗体阳性率为29.13%(90/309)。结论:(1)与病毒分离法比较,本室建立PCV2的PCR技术具有快速、重复性好、敏感性高的优点,可用于PCV2的病原诊断。(2)D(+)-氨基葡萄糖处理接毒细胞可以促进病毒的增殖,提高PCV2含量和病毒分离的阳性率。(3)氯仿抽提结合超速离心是PCV2抗原纯化的最佳方法。(4)优化建立的检测PCV2抗体的间接ELISA方法特异性强、重复性高,稳定性好可用于PCV2血清学诊断和血清学普查。
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