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乳清蛋白是指溶解分散在乳清中的蛋白质,牛奶中乳清蛋白约占总蛋白质含量的18%～20%。乳清蛋白中包含的功能性蛋白主要有β-乳球蛋白、α-乳白蛋白、乳铁蛋白、牛血清白蛋白、免疫球蛋白等组分。它们分别占总乳清蛋白的46.6%、17.5%、2.9%、5.8%和11.7%。此外,根据浓缩分离工艺的不同,乳清蛋白中还可能有含量不等的糖巨肽。乳清蛋白含有组成蛋白质的全部20种氨基酸,数量充足,组成合理,属于全价蛋白。因此,乳清蛋白作为一种营养价值较高的优质蛋白,被广泛应用于奶制品和配方食品中。但是产品在加工过程中要受到不同程度的热处理,而热处理过程不可避免地会导致乳清蛋白主要功能性组分(β-乳球蛋白、α-乳白蛋白、乳铁蛋白和免疫球蛋白等)发生变性,并且牛奶热处理的强度越强,功能性蛋白损失越多。同时,热处理过程导致乳清蛋白中生物活性组分活性损失甚至丧失,也会影响人体对奶制品中主要功能性乳清蛋白组分的生物利用率。然而,由于奶及奶制品中非变性乳清蛋白组分准确定量的检测方法缺失,生产企业无法对产品质量进行把控,监管部门也不能做到对终端产品的进行有效地监督管理,从而无法确保相关产品的食品安全。因此,开展非变性乳清蛋白组分检测方法的研究是行业的迫切需要,也是国家监管部门的所需,更是消费者健康安全的保证。本文从如下四个方面对非变性乳清蛋白组分的检测开展研究:1.建立奶及奶制品中非变性β-乳球蛋白的高效液相色谱检测方法试样溶液用冰醋酸调节pH至4.6,离心取上清,上清液中未变性的β-乳球蛋白经高效液相色谱分离,紫外检测器测定,外标法定量。未变性的β-乳球蛋白在生乳和液态奶中的定量限为25.0mg/kg,在奶粉中的定量限为50.0 mg/kg。该方法日间和日内的回收率和精密度实验,分别以超高温灭菌乳和奶粉为样品基质,添加β-乳球蛋白500 mg/kg、1000 mg/kg和2000 mg/kg三个浓度水平,每个浓度水平进行3次重复试验,连续测试3天,结果表明:超高温灭菌乳中β-乳球蛋白的回收率为103.1%～113.6%,RSD为0.4%～1.8%;奶粉中β-乳球蛋白的回收率为101.5%～111.0%,RSD为0.1%～3.2%。检测结果显示,本试验建立的非变性β-乳球蛋白检测方法可以用于不同奶及奶制品的检测。2.建立奶及奶制品中非变性乳铁蛋白的高效液相色谱检测方法试样中加入磷酸盐缓冲液提取,离心后取上清液,使用肝素亲和柱富集纯化上清液中的非变性乳铁蛋白,非变性乳铁蛋白经高效液相色谱分离,紫外检测器测定,外标法定量。非变性乳铁蛋白在生乳和液态奶中的定量限为5.0 mg/kg,在奶粉中的定量限为10.0 mg/kg。该方法日间和日内的回收率和精密度实验,以超高温灭菌乳为样品基质,添加乳铁蛋白5 mg/kg、20 mg/kg和50 mg/kg三个浓度水平;以奶粉为样品基质,添加乳铁蛋白10 mg/kg、50 mg/kg和100 mg/kg三个浓度水平,每个浓度水平进行3次重复试验,连续测试3天,结果表明:超高温灭菌乳中乳铁蛋白的回收率为92.9%～109.3%,RSD为1.5%～3.2%;奶粉中乳铁蛋白的回收率为97.6%～107.7%,RSD为1.4%～3.1%。检测结果显示,本试验建立的非变性乳铁蛋白检测方法可以用于不同奶及奶制品的检测。3.建立奶及奶制品中非变性免疫球蛋白G(IgG)的定量检测方法试样中加入磷酸盐缓冲液提取,离心后取上清液,使用Protein G免疫亲和柱富集纯化上清液中的非变性IgG,非变性IgG经高效液相色谱分离,紫外检测器测定,外标法定量。非变性IgG在生乳、液态奶和奶粉中的定量限为100.0 mg/kg。该方法日间和日内的回收率和精密度实验,分别以超高温灭菌乳和奶粉为样品基质,添加IgG浓度为100 mg/kg、200 mg/kg和400 mg/kg三个浓度水平,每个浓度水平进行3次重复试验,连续测试3天,结果表明:超高温灭菌乳中IgG的回收率为92.0%～103.9%,RSD为 1.2%～4.6%;奶粉中 IgG 的回收率为 105.0%～122.5%,RSD为 1.2%～4.2%。检测结果显示,本试验建立的非变性乳铁蛋白IgG检测方法可以用于不同奶及奶制品的检测。4.建立婴儿配方奶粉中乳清蛋白总量的毛细管凝胶电泳检测方法称取135±5 mg脱脂奶粉或500±20 mg婴儿配方奶粉至10 mL刻度离心管中,用去离子水定容到5 mL,涡旋混合均匀。将1%SDS样品溶液与10 kDa IS蛋白质以84:1比例混合,制备分析预备溶液。移取10μL样品溶液至2.0 mL微量离心管中,依次向微量离心管中加入85μL分析预备溶液和5μL β-巯基乙醇,充分混合,然后在95±5℃的水浴中加热10 min。冷却至室温,然后在室温下以7000 r/min离心1 min,上清液经毛细管凝胶电泳分离,在220 nm紫外波长下检测。脱脂奶粉或婴儿配方奶粉中的酪蛋白和乳清蛋白被分离成两组不互相干扰的蛋白质峰组,根据这两组蛋白质组的峰面积,以及乳清蛋白对酪蛋白的质量对面积校正系数,利用峰面积归一化法,计算出乳清蛋白在婴幼儿配方奶粉总蛋白质中的百分含量。该方法的回收率以脱脂奶粉为样品基质,通过添加不同浓度的浓缩乳清蛋白,每个浓度水平进行3次重复试验,连续测试3天,回收率为91.3%～99.8%;该方法的精密度以脱脂奶粉和婴儿配方奶粉为样品基质,每个样品进行3次重复试验,连续测试3天,RSD为0.1%～2.9%。检测结果显示,本试验建立的婴儿配方奶粉中乳清蛋白总量检测方法满足方法学要求,适用于婴儿配方奶粉的检测。